实验一 酵母RNA的提取及含量测定(紫外吸收法)

1实验一酵母RNA的提取及含量测定一、实验目的与要求1、了解并掌握稀碱法提取RNA的原理和方法。2、熟悉和掌握紫外吸收法测定核酸含量原理和操作方法，3、熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用方法。二、实验原理由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也很各异。一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验是最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中。向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。上述方法提取的RNA具有生物活性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。浓盐法使用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3-4h，迅速冷却，提取液经离心后,上清液用乙醇沉淀RNA。稀碱法使用稀碱使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。酵母含RNA达2.67-10.0%，而DNA含量仅为0.03-0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统（-C=C一C=C-），能够强烈吸收250-280nm波长的紫外光。核酸（DNA,RNA）的最大紫外吸收值在260nm处。遵照Lambert-Beer定律，可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。在不同pH溶液中嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同，紫外吸收光也随之表现出明显的差异，它们的摩尔消光系数也随之不同。所以，在测定核酸物质时均应在固定的pH溶液中进行。核酸的摩尔消光系数（或吸收系数），通常以ε（ρ）来表示，即每升含有一摩尔核酸磷的溶液在260nm波长处的消光值（即光密度，或称为光吸收）。核酸的摩尔消光系数不是一个常数，而是依赖于材料的前处理、溶液的pH和离子2强度发生变化。RNA溶液（pH=7.0）的ε（ρ）=7700-7800，RNA的含磷量为9.5%，含1μg/mLRNA溶液的光密度为0.022-0.024。因此，测定未知浓度的DNA（RNA）溶液的光密度OD260nm，即可计算测出其中核酸的含量。该法简单、快速、灵敏度高，如核酸3μg/mL的含量即可测出。对于含有微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质的核酸样品，测定误差较小。蛋白质由于含有芳香族氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处，在260nm波长处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中的蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。三、主要仪器和试剂试剂：啤酒酵母粉、0.04MNaOH溶液、95%乙醇、乙醚、酸性乙醇溶液：30mL乙醇加0.3mLHCl。仪器：紫外分光光度计、离心机、真空干燥箱、三角瓶、烧杯、水浴锅。四、实验步骤 1、称取5g干酵母粉，用30mL0.04MNaOH溶液分步在研钵中研磨均匀后，转入2支50ml比色管，沸水浴加热35min，冷却，转入离心管，4000r/min，离心15min，将上清慢慢倾入装有10mL酸性乙醇的离心管，边加边搅动。2、加毕，静置，待RNA沉淀完全后，5000r/min离心5min。弃去上清液。用95％乙醇分步将沉淀转移至布氏漏斗抽滤并洗涤，消耗95％乙醇体积总约30ml；3、再用乙醚洗涤沉淀两次，消耗体积总约20ml，沉淀在空气中干燥。称量所得RNA粗品的重量（减去滤纸重量），并记录该数据。4、RNA粗品中RNA纯度测定：将样品配制成含5～50μg核酸/mL的溶液：将上述RNA粗品溶解于100ml容量瓶，定容，静置，取上清液于紫外分光光度计上测定260nm吸收值，按下式计算纯品RNA浓度。若O.D260读数过大，则根据O.D260值再做适当稀释。五、计算：O.D260－260nm波长处的光密度读数；L－为比色杯的厚度，一般为1或0.5；0.024为1μgRNA/mL的光密度；结果RNA浓度=O.D260/0.024×L=0.386/0.024μg/mL=16×10^-6g/ml干酵母粉RNA含量=RNA重/干酵母称重×100%=16×10^-6g/ml×100ml/5g×100%=0.032%七、思考题1.破酵母细胞时为什么要在沸水浴中进行?答：由于酵母细胞外有一层厚厚的细胞壁，而RNA存在于细胞质中，所以必需将酵母细胞的细胞壁研磨破碎后才能提取出RNA。加入NaOH之后水浴煮沸30min的作用是促进细胞壁变性，使类脂、甘露聚糖、葡聚糖等成分部分分解，使蛋白质变性，从而使细胞破裂，RNA则从细胞中分离出来。另外细胞中含有多种分解RNA的酶类（如RNase等），为了避免RNA在提取过程中被降解，得到较为完整的RNA分子，破碎酵母细胞时应在沸水中进行，这样可以使细胞中降解RNA的蛋白酶类活性受到抑制甚至变性失活，从而起到保护RNA分子的作用。2.为什么用酵母作为实验原料？如何使RNA从酵母中释放出来？RNA的等电点是多少？答：酵母繁殖快，生长周期短；其细胞质中的核酸大部分是RNA，而DNA很少；RNA提取液与菌体分离比较容易，因此酵母是提取RNA的好材料。工业上将RNA从细胞中释放出来主要有三种方法，包括稀碱法、浓盐法和自溶法。（1）稀碱法是在一定的碱浓度下，使构成细胞壁的蛋白质、脂肪及糖的化合物得到水解，从而破坏细胞壁，使RNA从细胞中释放出来，该方法属于化学破壁法。（2）浓盐法是基于改变酵母细胞的渗透压，是细胞自身破裂而释放出RNA，即利用高浓度的盐（10%NaCl）在90～100°C条件下改变了细胞膜通透性，并将核蛋白体解离成RNA和蛋白质而使RNA释放到盐溶液中。同时，90～100°C的高温可破坏磷酸单酯酶和磷酸二酯酶的活力，避免RNA的降解。该方法属于物理化学破壁法。（3）自溶法是利用某些酵母菌种在发酵结束后，细胞中的溶酶体膜破裂，使得溶酶体中的水解酶释放到细胞之中，利用菌体自身的酶系将细胞溶解，从而释放出RNA。通常自溶法的菌浓度为2%，PH值9.5～10，自溶温度以60～65°C为宜。RNA的等电点为PH2.5。根据核酸在等电点溶解度最小的性质，将溶液在低温下调pH至2.0～2.5，RNA则以白色絮状沉淀形式从盐溶液中析出。再次离心，固液分离，便可获得RNA粗产品。3为什么用稀碱溶液可以使酵母细胞裂解？答：酵母菌的细胞壁呈“三明治”结构——外层为甘露聚糖，内层为葡聚糖，中间层为一层蛋白质分子（包括多种酶类），此外细胞壁壁上还含有少量的类脂和几丁质。稀碱溶液能够对酵母菌细胞壁和细胞膜上的脂类起到抽提作用，脂类发生皂化反应从而被分解，使细胞穿孔。同时细胞壁的聚糖成分在碱液中会部分水解，蛋白质（包括多种酶类）也会发生变性，从而增加酵母细胞的通透性，酵母细胞原生质膜失去选择透过性，细胞就破裂使RNA流出。4.核酸的溶解性质是什么?常用什么试剂分离沉淀核酸?答：核酸是具有极性的高分子物质，