第八讲 蛋白质的1-4级结构

第一节蛋白质氨基酸第二节蛋白质结构第三节蛋白质功能第四节蛋白质性质与生化分析

蛋白质的化学10/18/20231氨基酸的结构通式羧基氨基10/18/20232非极性氨基酸甘氨酸脯氨酸亮氨酸丙氨酸苯丙氨酸甲硫氨酸缬氨酸色氨酸异亮氨酸10/18/20233极性不带电荷氨基酸丝氨酸苏氨酸天冬酰胺谷氨酰胺酪氨酸半胱氨酸10/18/20234带负电荷氨基酸天冬氨酸谷氨酸10/18/20235带正电荷氨基酸赖氨酸精氨酸组氨酸10/18/20236蛋白质的1-4级结构层次氨基酸是如何形成蛋白质结构的？10/18/20237第二节蛋白质结构蛋白质的一级结构----多肽链10/18/20238一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基之间失水形成的酰胺键称为肽键，所形成的化合物称为肽。一、多肽与肽键的形成10/18/20239肽键N=C0.127nm键长=0.132nmN-C

0.148nm肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。10/18/202310肽平面或酰胺平面：组成肽单位的4个原子和2个相邻的α碳原子都处于同一个平面内，此刚性结构的平面称为肽平面或酰胺平面。肽单位：实际就是一个肽平面二.肽单位

肽键的四个原子和与之相连的两个α-碳原子所组成的基团。10/18/202311

二面角

两相邻酰胺平面之间，能以共同的Cα为定点而旋转，绕Cα-N键旋转的角度称φ角，绕C-Cα键旋转的角度称ψ角。φ和ψ称作二面角，亦称构象角酰胺平面与α-碳原子之间形成的二面角（φ和ψ）10/18/202312三、肽链中AA的排列顺序和命名通常在多肽链的一端含有一个游离的

-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离的

-羧基，称为羧基端或C-端。氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。如下面的五肽可表示为：

Ser-Gly-Tyr-Val-Leu10/18/202313肽键和肽的结构如图所示丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸10/18/202314

多肽链结构示意图10/18/202315四、天然存在的活性肽自然界中有自由存在的活性肽，主要有：1.谷胱甘肽（GSH）：三肽（Glu—Cys—Gly），含有自由的巯基，具有很强的还原性，可作为体内重要的还原剂，保护某些蛋白质或酶分子中的巯基免遭氧化，使其处于活性状态。分子中具有一个由谷氨酸的-羧基和半胱氨酸的

-氨基脱水缩合的-肽键10/18/2023162.脑啡肽：为五肽，具有镇痛作用，它们在中枢神经系统中形成，是体内自己产生的一类鸦片剂。10/18/2023173.牛催产素与加压素：

均为九肽，分子中含有一对二硫键，两者结构类似。前者第八位为Leu，后者为Arg。前者可刺激子宫的收缩，促进分娩。后者可促进小动脉收缩，使血压升高，也有抗利尿作用，参与水、盐代谢的调节。

牛催产素SS Cys·Tyr·Ile·Gln·Asn·Cys·Pro·Leu·Gly-NH2

牛加压素SS Cys·Tyr·Phe·Gln·Asn·Cys·Pro·Arg·Gly-NH210/18/202318定义——1969年，国际纯化学与应用化学委员会（IUPAC）规定：

蛋白质的一级结构指蛋白质多肽连中AA的排列顺序，包括二硫键的位置。

2.一级结构的意义五.蛋白质的一级结构10/18/20231910/18/202320

3.蛋白质一级结构的测定（1）.测定蛋白质一级结构的要求：a、样品必须是均一的，纯度应在97%以上；b、知道蛋白质的分子质量，其误差允许在10%左右；10/18/20232110/18/202322（2）.测定一级结构的基本原理和方法基本策略：

氨基酸顺序直测法＋片段重叠法技术路线：10/18/202323将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序

将肽段分离并测出顺序专一性裂解末端氨基酸测定二硫键拆开纯蛋白质基本方法路线：10/18/202324①测定蛋白质分子中多肽链的数目。通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质相对分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。②拆分蛋白质的多肽链，断开多肽链内二硫键10/18/202325胰岛素

-巯基乙醇碘乙酸二硫键的断裂几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇(还原法)处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂（ICH2COOH）保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。10/18/202326③

分析每一条多肽链的氨基酸组成经分离、纯化的多肽链一部分样品进行完全水解，测定它的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比或各种残基的数目。④

鉴定多肽链N－末端、C－末端氨基酸残基

Sanger法（二硝基氟苯反应）DNS法（丹磺酰氯反应）

Edman法（异硫氰酸苯脂反应）氨肽酶法肼解法羧肽酶法

LiBH4还原法N端C端10/18/202327+DNFB（dinitrofiuorobenzene）氨基酸弱碱中DNP-AA(黄色)1.（sanger反应）+HF二硝基氟苯10/18/202328Sanger法DNFB

（二硝基氟苯）反应黄色:根据它在薄层层析或纸电泳中的迁移特性进行鉴定10/18/20232910/18/2023302.丹磺酰氯反应（DNS）+HCI有荧光丹磺酰氯是二甲氨基萘磺酰氯的简称10/18/202331（DNS法）丹磺酰氯反应-HCl+氨基酸混合物水解多肽多肽DNS-氨基酸具有荧光10/18/202332+PITC弱碱中(400C)苯硫乙内酰脲(PTH-AA)(无水氢氟酸中)H+苯氨基硫甲酰氨基酸（PTC-氨基酸）3.（Edman反应）10/18/202333Edman法（异硫氰酸苯脂反应）PITC用层析法分离10/18/20233410/18/202335酶解法：如胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶化学法：如溴化氰法羟胺法⑤裂解多肽链成较小的片段10/18/202336胰蛋白酶R1=Lys和Arg侧链（专一性较强，水解速度快）。R2=Pro水解受抑。10/18/202337糜蛋白酶或胰凝乳蛋白酶：R1=Phe,Trp,Tyr时水解快;R1=Leu，Met和His水解稍慢。R2=Pro水解受抑。10/18/202338胃蛋白酶R1和R2＝Phe,Trp,Tyr;Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度较快。R1=Pro水解受抑10/18/202339嗜热菌蛋白酶R2=Phe,Trp,Tyr;Leu，Ile,Met以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。R2=Pro或Gly

水解受抑。R1或R3=Pro水解受抑。10/18/202340⑥测定各肽段的氨基酸序列

基本方法：Sanger法

Edman降解法

DNS-Edman测序法

蛋白质顺序仪测序10/18/202341PTC肽Edman降解法为例10/18/202342环化裂解ATZ-AA噻唑呤酮苯氨10/18/202343PTH转换10/18/202344⑦

片段重叠法重建完整多肽链一级结构

所得资料：

氨基末端残基H羧基末端残基S第一套肽段第二套肽段

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HO10/18/202345末端残基HS末端肽段HOWT

APS第一套肽段HOWT

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PS第二套肽段HO

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推断全顺序HOWTOUSEOVERLAPS

借助重叠法确定肽段次序：10/18/202346⑧确定半胱氨酸残基间形成二硫键交联桥的位置

蛋白质一级结构的顺序测定完成后，将未拆开二硫键的同一种蛋白质再一次进行专一性的酶解，由此就可以确定完整的蛋白质中二硫键的位置。10/18/202347确定原多肽链中二硫键的位置。酶降解分离测定10/18/202348对角线电泳：

把水解的混合肽段点到滤纸中央，在pH6.5的条件下，进行第一向电泳，肽段将按其大小及电荷的不同分离开来。然后把滤纸暴露在过甲酸蒸气中，使-S-S-断裂。这时每个含二硫键的肽段被氧化成一对含半胱氨磺酸的肽。滤纸旋转90度角在与第一向完全相同的条件下进行第二向电泳。在这里，大多数肽段的迁移率未变，并将位于滤纸的一条对角线上，而含半胱氨磺酸的肽段比原来含二硫键的肽小而负电荷增加，结果它们都偏离了对角线。肽斑可用茚三酮显色确定。10/18/202349+-+-第二向第一向abBrown和Hartlay对角线电泳图解pH6.5图中a、b两个斑点是由一个二硫键断裂产生的肽段二硫键位置的确定10/18/202350蛋白质的二级结构10/18/202351肽平面或酰胺平面：10/18/202352蛋白质的二级结构是指多肽链的主链本身通过氢键沿一定方向盘绕、折叠而形成的构象.它只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。(注:二级结构不涉及侧链的构象)主要有

-螺旋、-折叠、-转角、无规卷曲。一.蛋白质二级结构的定义10/18/202353氢键：

x—H…y

疏水作用力：是指非极性基团即疏水基团为了避开水相而群集在一起的集合力

范德华力：在物质的聚集状态中，分子与分子之间存在着一种较弱的作用力

离子键：它是由带相反电荷的两个基团间的静电吸引所形成的

二硫键：是两个硫原子之间所形成的共价键二.蛋白质的各种二级结构10/18/202354多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构，螺旋一周，沿轴上升的距离即螺距为0.54nm,含3.6个氨基酸残基；两个氨基酸之间的距离为0.15nm;

每个aa残基沿轴旋转100度.肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行，每个氨基酸残基的C=O氧与其后第四个氨基酸残基的N-H氢形成氢键。绝大多数天然蛋白质中的

-螺旋几乎都是右手螺旋。

-螺旋都是由L-型氨基酸构成的（Gly除外）。1.-螺旋及结构特点

-螺旋10/18/20235510/18/20235610/18/202357螺距0.54nm每残基的轴向高度0.15nm每残基绕轴旋转100o10/18/2023582.α-螺旋结构形成的限制因素:凡是有Pro存在的地方,不能形成。因Pro形成的肽键N原子上没有H,不可能形成氢键。静电斥力。若一段肽链有多个Glu或Asp相邻,则因pH=7.0时都带负电荷,防碍α螺旋的形成;同样多个碱性氨基酸残基在一段肽段内,正电荷相斥,也防碍α螺旋的形成。空间位阻。如Asn、Leu侧链很大，防碍α螺旋的形成。10/18/202359

-折叠（-sheet）

-折叠或

-折叠片也称

-结构或

-构象，它