陕西茯砖茶中金花菌的分离与鉴定

陕西茯砖茶中金花菌的分离与鉴定

最早的沱砖茶是明初陕西茶商在陕西用陕西茶作为原料修建的紧压茶。金色的细菌生长在他们的砖体内和周围。人们通常称之为“金华”菌。随着“金花”菌的生长繁殖,其他微生物的生长会受到抑制,“金花”菌吸收茯砖茶上的营养物质进行代谢转化,产生各种胞外酶和生物活性物质,赋予茯砖茶独特的品质和功能,这正是茯砖茶不同于其它黑茶茶品的独特之处。近几年来受到人们的关注。对于茯砖茶中“金花”菌的研究多是以湖南、四川等地的茶样为研究对象,而作为茯砖茶的发源地陕西,对陕西茯砖茶中“金花”菌的研究还鲜见报道。通过微生物经典鉴定方法结合DNA序列对陕西茯砖茶中的“金花”菌进行研究。1材料和方法1.1茶叶测试陕西苍山茶叶有限公司提供1.2鉴定培养基分离纯化培养基:CZG(5%NaCl)培养基;鉴定培养基:PDA、CZG(5%NaCl)、CZG(14%NaCl)、察氏琼脂培养基、20%蔗糖察氏琼脂培养基。1.3czg菌悬液的稀释、标准溶液及镜检无杂菌的培养称取10g茯砖茶茶叶,加入到装有90mL无菌水和玻璃珠的250mL的三角瓶中,充分震荡10min。用灭过菌的移液管吸取1mL,按10倍进行梯度稀释到102,103,104,105,106,将稀释后的菌悬液涂布到CZG(5%NaCl)培养基上,在28℃下培养。选择适当稀释浓度的菌落,进行划线分离,28℃培养后挑取单菌落,多次划线分离挑取单菌落后镜检无杂菌。将纯化菌种转接斜面保存。1.4培养单菌种在无菌条件下,取3环菌种到含玻璃珠的50mL的无菌水中,在28℃,150r/min震荡10min,用无菌漏斗和脱脂棉过滤得单孢子悬液,培养时的单菌落便于准确测量菌落直径,取0.1~0.2mL单孢子悬液分别接种到PDA,CZG(5%NaCl),CZG(14%NaCl),察氏琼脂培养基,20%蔗糖察氏琼脂培养基上进行涂布培养。在28℃培养观察菌落的生长情况。1.5光学显微镜和扫描电镜观察在光学显微镜下对其菌体形态、繁殖特性进行观察。从中挑取菌落、在表面刮取孢子干燥后常规制片在扫描电镜下观察。1.6测序结果及测序结果从CZG(5%NaCl)培养基上生长的“金花”菌的菌丝中提取基因组DNA,进行ITS测序。ITS序列扩增采用引物ITS1和ITS4,测序工作由生工生物工程有限公司完成。2结果与分析2.1培养基上的菌落形态“金花”菌在营养琼脂培养基上的菌落形态见图1-A。在28℃培养3d后菌落直径为0.6cm~0.7cm,菌落中间会长出黄色的闭囊壳,菌落为规则的圆形且密集。7d菌落直径达1.5cm~1.6cm,从菌落中间开始颜色逐渐加深,变为黑褐色,菌落边缘培养基颜色也逐渐加深变为黑褐色。培养15d后菌落长满平皿,在整个生长过程为有性生殖方式。“金花”菌在改良察氏培养基(含5%NaCl)上的菌落形态见图1-B。菌丝为白色丝绒状,之后再中间长出一个乳白色的点(大量菌丝生长在一起),随着菌丝的延伸,乳白色也随之长大,菌落颜色逐渐加深,由乳白色变为淡黄色(闭囊壳长出)。3d后菌落直径达1.4cm~1.6cm,黄色加深,中间密集且隆起,淡黄色变为金黄色。7d后菌落平均直径达2.5cm~2.7cm。在整个生长过程为有性生殖方式。“金花”菌在察氏琼脂培养基上的菌落形态见图1-C,培养3d后菌落直径达0.4cm~0.6cm,培养7d后菌落直径达2.5cm~2.7cm,菌落菌丝生长比较快,菌落表面会长出黄色的闭囊壳且闭囊壳比较稀疏,不像CZG(5%NaCl)培养基中闭囊壳那么密集。菌落边缘培养基颜色较早变为黑褐色。“金花”菌在改良察氏培养基(含14%NaCl)上的菌落形态见图1-D。培养3d后菌落直径达0.9cm~1.95cm,菌落未出现黄色,在菌落表面长出灰绿色的分生孢子,6d后菌落中间开始变黄长出闭囊壳。10d菌落直径达2.4cm~2.5cm。在此培养基上“金花”菌的有性型与无性型同时存在。“金花”菌在20%蔗糖察氏琼脂培养基上的菌落形态见图1-E,菌落生长较快,28℃培养3d直径达0.8cm~1.2cm,培养5d达1.8cm~2.2cm,8d长满平皿。菌落比察氏琼脂培养基黄色闭囊壳生长较多且密集。2.2网状联合现象在培养基上“金花”菌丝形态为丝绒状。在光学显微镜下该菌的菌丝有横隔是多细胞构造,具不规则分枝(图2-A),菌丝之间有网状联合现象(图2-B)。闭囊壳形成过程是在在受精体的上半部分产生一条弯管形的受精丝(图2-C),受精丝与多核的雄器接触后,雄器内的细胞质和细胞核通过受精丝进入产囊器内,同时在两性器官表面生出许多缠绕在一起的菌丝将其包围(图2-D),形成初期的闭囊壳。2.2药物代谢和子囊孢子释放出多态性“金花”菌的有性世代会长出大量闭囊壳(图3-A),闭囊壳表面为黄色,球形。在闭囊壳里面包裹有大量的子囊,闭囊壳破裂释放出子囊(图3-B),子囊近球形,每个子囊里面都含有8个子囊孢子(图3-C),子囊孢子椭圆形或球形(图3-D)。“金花”菌的无性世代会长出分生孢子(图3-E),在菌丝顶端形成膨大的顶囊,依其部位有分生孢子梗,顶囊,小梗,分生孢子。分生孢子呈链,分生孢子球形或椭圆形(图3-F)。2.3表面粗糙度b扫描电镜下观察到培养基上生长的闭囊壳,球形或近球形,直径80μm~150μm,表面粗糙。闭囊壳破裂释放出子囊(图4-C),子囊球形或近球形,直径10μm左右,子囊易释放出子囊孢子,子囊孢子有两个明显的冠状突起,子囊孢子大小为(4~5)μm×(5~6)μm。2.4“治疗”pcr扩增结果将“金花”菌的ITS区域扩增的序列片段在NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation数据库上进行nucleotideblast比对,其结果为:“金花”菌的ITS片段为532bp与数据库中的Eurotiumcristatum(ACCESSION:GU784865)相似度为100%。3形态鉴定原则虽然“金花”菌在不同培养基上的菌落形态表现出多样性,但在相同的生殖方式上其菌体形态基本一致。“金花”菌是产生有性型和无性型的全型真菌,在通常条件下以有性生殖方式存在,其无性