应用珠磨-cab法提取瘤胃微生物总dna的研究

应用珠磨-cab法提取瘤胃微生物总dna的研究

反刍动物肿瘤胃是一个极其复杂的共生生态系统。瘤胃微生物种类繁多,包括瘤胃原虫、瘤胃细菌和厌氧真菌,还有少数的噬菌体,其中细菌的数量在瘤胃中占有很大比例。这些微生物具有多种生理功能,可以帮助反刍动物消化纤维素同时合成大量的菌体蛋白,为反刍动物提供正常生命活动所必需的营养物质。目前对瘤胃微生态的研究一直是热点,但由于瘤胃环境的特殊性如需要严格的厌氧条件和复杂的营养因子,并且瘤胃中绝大多数的微生物不能或是很难在体外培养,即便分离培养出的微生物也有可能不是所期望的瘤胃中的优势种群,传统培养技术对瘤胃微生物多样性的研究存在着局限性。近年来,随着分子生物学的迅速发展,许多学者采用在基因组水平上对复杂的瘤胃微生物进行分析,克服了传统培养的局限性,为深入研究瘤胃微生态提供了新的思路和方法。然而通过分子手段对瘤胃微生物研究的基础和关键的一步是对微生物DNA的提取,目前报道的对瘤胃微生物DNA提取方法有多种,如物理方法珠磨仪破碎法、反复冻融SDS/蛋白酶K法、液氮研磨法等,与化学方法CTAB、SDS等。瘤胃微生物种类复杂多样,单一的提取方法很难获得完整的微生物DNA片段。基于此,本试验旨在通过将常用几种提取微生物DNA的方法进行综合比较,探讨影响微生物DNA提取效果的重要因素,优化出一种最有效的瘤胃微生物DNA的提取方法。1材料和方法1.1材料表面1.2蛋白酶、琼脂糖十二烷基磺酸钠(SDS)、十六烷基三甲溴化胺(CTAB)、蛋白酶K、琼脂糖,均购自Sigma。其他国内生产的化学试剂均为分析纯级。引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成,引物序列如下表1。1.3主要设备1.4方法1.4.1过滤-过滤液组采集瘤胃内容物及瘤胃液,混匀,然后4层纱布过滤,滤液10000g离心5min,弃上清,沉淀用生理盐水溶解,放置-70℃保存。1.4.2dna的提取珠磨-CTAB法:取荷斯坦奶牛的瘤胃内容物及其瘤胃液1.5mL加入到装有0.3g玻璃碎珠的小型离心管中,在12000g的条件下离心5min,除去上清;加入1.5mL的PBS溶液在12000g的条件下离心5min,除去上清;加入800μLCTABBuffer(4gCTAB、16.364gNaCl、1mol/LTris·HCl20mLpH8.0、0.5mol/LEDTA8mL,定容至200mL灭菌)Beat120s。在70℃条件下培养20min,然后在10000g条件下离心10min。将上清液转移到新的离心管中,加入5μL的RNA酶(10mg/mL)在37℃条件下培养30min;加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液振荡(15~30s)呈白色乳浊液。13000r/min条件下离心10min,取上清加入到新的离心管中。再用等体积酚∶氯仿∶异戊醇抽提直至界面清晰为止。加入0.8体积的异丙醇轻轻上下混匀几次。在室温条件下放置5min让DNA沉淀在-20℃过夜。在13000r/min条件下离心15~20min。小心倒出上清。可以看到灰白色的DNA沉淀。加入750μL70%的冷乙醇,将白色沉淀轻轻弹起。在13000r/min条件下离心10~15min。倒出上清,风干DNA。加入100μL的TEBuffer(视沉淀体积而定)在70℃条件下5min。用分光光度计测定DNA的浓度。珠磨-SDS法:SDSbuffer成分如下:100mmol/LNaCl、500mmol/LTris·HClpH8.0、10%SDS,其他提取过程同珠磨-CTAB方法。反复冻融-CTAB法:参照文献冻融法和Murray等提出的CATB方法,将冻融法和CATB法相结合。步骤如下:取荷斯坦奶牛瘤胃内容物及其瘤胃液0.5mL置于灭菌的2mL离心管中;加入400μLDNA抽提缓冲液(100mmol/LTris·HCl,pH8.0;100mmol/LEDTA;100mmol/L磷酸钠缓冲液,pH8.0;1.5mo1/LNaCl;1%CTAB)充分混匀,置液氮中完全冻结温至融化;重复该步骤2次(液氮中冷冻约3~5min),取出在60℃水浴中保温至融化;重复该步骤2次,共3次;60℃保温1h,每隔15~20min颠倒混匀几次;加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1),10000g,4℃离心10min;上清液转移至一新的离心管中,重复2次如上清液仍浑浊,可增加1次;上清液中加1/10倍体积3mol/L乙酸钠(pH7.0)及2倍体积冷无水乙醇,轻轻混匀,置于-20℃过夜;10000g,4℃离心15min;沉淀用70%乙醇和冷无水乙醇各洗1次,自然干燥;沉淀用100μLTE(pH8.0)溶解;将其DNA原液进行稀释后,取3μL在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳,观察DNA纯度,用分光光度计测定DNA的浓度。其余DNA置于-20℃下保存备用。反复冻融-SDS(蛋白酶K)法:取荷斯坦奶牛瘤胃内容物及其瘤胃液0.5mL置于灭菌的2mL离心管中;加900μLSDS提取液(100mmol/LNaCl、500mmol/LTris·HClpH8.0、10%SDS),置液氮中完全冻结温至融化;重复该步骤2次,(液氮中冷冻约3~5min),取出在60℃水浴中保温至融化;重复该步骤2次,共3次;加入120μL蛋白酶K(20mg/mL)。60℃保温1h,每隔15~20min颠倒混匀几次;6000g室温离心10min;收集上清液,加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1),10000g,4℃离心10min;上清液转移至一新的离心管中,重复2次如上清液仍浑浊,可增加1次;上清液中加1/10倍体积3mol/L乙酸钠(pH7.0)及2倍体积冷无水乙醇,轻轻混匀,置于-20℃过夜;10000g,4℃离心15min;沉淀用70%乙醇和冷无水乙醇各洗1次,自然干燥;沉淀用100μLTE(pH8.0)溶解;将其DNA原液进行稀释后,取3μL在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳,观察DNA纯度,用分光光度计测定DNA的浓度。其余DNA置于-20℃下保存备用。液氮研磨-CTAB法:先将瘤胃液样品中加入适量液氮,在灭菌的研钵上快速研磨,然后加入抽提液CTABBuffer(100mmol/LTris·HCl,pH8.0;100mmol/LEDTA;100mmol/L磷酸钠缓冲液,pH8.0;1.5mo1/LNaCl;1%CTAB)。反复颠倒数次,然后离心取上清。6000r/min,离心5min,取上清,加20mg/mL蛋白酶K10μL,65℃水浴,30min,然后再加等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提2次,12000g,4℃离心2min。取上清加2倍冷乙醇,沉淀1h,16000g,4℃离心10min,弃上清。用70%乙醇洗涤沉淀,晾干,用TE(pH8.0,含10mg/μLRNase)溶解,放置37℃水浴30min。酚和氯仿抽提1次,12000g,4℃离心2min。上清加2倍体积乙醇,过夜。16000g,4℃离心10min,弃上清。70%乙醇洗涤沉淀,晾干,溶于TE(pH8.0)。液氮研磨-SDS法:SDSBuffer成分:100mmol/LNaCl、500mmol/LTris·HClpH8.0、10%SDS,其他提取过程同CTAB法方法。1.5粗提dna检测用紫外分光光度计于260、280nm波长下测定粗提DNA吸光值及浓度,计算出OD260/OD280值。用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。1.6肿瘤胃微生物dna的pcr检测1.6.1pcr反应体系及参数引物F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;引物R:5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′PCR反应体系为10×缓冲液2.5μL,10mmo1/L的dNTP2.5μL,10μmol/L的引物各1.0μL,25mmol/L的MgC12为2.5μL,模板(瘤胃总DNA)2.5μL,TaqDNA聚合酶0.5μL,双蒸水为12.5μL,总体积25μL。反应参数:94℃变性3min;94℃40s;54℃50s;72℃2min;35个循环;72℃延伸10min。1.6.2pcr反应参数引物F:5′-ACKGCTCAGTAACACGT-3′;引物R:5′-GTGCTCCCCCGCCAATTCCT-3′。PCR反应体系为10×缓冲液2.5μL,10mmo1/L的dNTP2.5μL,10μmol/L的引物各1.0μL,25mmol/L的MgC12为2.5μL,模板(瘤胃总DNA)2.5μL,TaqDNA聚合酶0.5μL,双蒸水为12.5μL,总体积25μL。反应参数:95℃变性4min;95℃1min;60℃1min;72℃1min;35个循环;72℃延伸7min。2结果与分析2.1反复冻融-sds法与ctab法由图1可以看到,珠磨-CTAB法提取的DNA具有较亮的条带,然而珠磨-SDS法提取的DNA条带明显具有拖尾现象,说明DNA降解十分严重。并且在该方法的凝胶泳道前部,可见较亮的RNA谱带,说明提取物中存在未降解完全的RNA,需要进行下一步的纯化。图2为反复冻融法与CTAB和SDS2种化学方法结合提取的DNA电泳图,通过条带可见反复冻融-CTAB提取的DNA的质量优于反复冻融-SDS法。同时在电泳点样胶孔中含有很多的多糖和大分子不明杂质,并且后者提取的DNA仍有一定的降解。图3为液氮研磨法与CTAB和SDS2种化学方法结合提取的DNA电泳图,可见这2种方法提取DNA条带亮度微弱,并且RNA仍未降解完全,同时在点样仍存在大量不明杂质。2.2检测dna浓度2.3dna扩增效果左右的瘤胃细菌和古细菌的16SrDNA序列。与试验预计扩增的片段长度一致,通过条带可以看出DNA扩增效果稳定,重复性好。检测结果说明利用珠磨-CTAB法可以得到瘤胃微生态中绝大部分微生物的基因组DNA,可以进行下一步分子生物学实验。3盐析法提取瘤胃是一个含有复杂微生物群体的厌氧环境,由于它本身具有复杂性同时对厌氧条件的要求极高,因此大多数瘤胃微生物在体外难以成功培养。随着分子生物学方法的发展,直接从样品中提取微生物DNA可以克服传统培养的弊端。在本试验中,几种方法提取出DNA浓度的不同,分析其原因可能在于对菌群细胞裂解存在差异以及对微生物DNA的破碎程度不同,在提取DNA过程中,细胞裂解的过程是非常重要的,因细胞结构及其所含成分不同,样品中细胞裂解的程度也有所不同。采用SDS裂解液来溶解细胞膜中的脂溶性物质,促使细胞膜破裂,释放DNA,但同时沉淀大量的多糖。利用非离子型去污剂CTAB结合玻璃珠破碎法则减少了杂质的生成,同时微生物DNA没有大量降解,效果最佳,较适合对瘤胃微生物DNA的提取。试验结果表明,采用珠磨-CTAB法提取获得的瘤胃微生物总DNA结果优于其他方法,粗提DNA的产量达到905.1μg/mL,OD260/OD280值在1.8以上,PCR扩增细菌与古菌的16SrDNA片段达到了预期的结果。李旦等报道,珠磨法与反复冻融法结合化学提取液,可以获得比较完整的瘤胃微生物DNA,但本试验利用反复冻融法所提取的DNA在电泳点样胶孔中含有很多的多糖和大分子不明杂质,这可能是在利用化学裂解液破碎细胞膜时,释放DNA的同时沉淀了大量的多糖和蛋白。反复冻融法在提取环境微生物及海洋微生物DNA中的应用较为广泛。液氮研磨法虽然也能获得DNA,但在本试验中提取的DNA浓度较低,效果不稳定。因为这种方法有很多外界因素的影响,比如研磨过程中的力度大小在一定程度上影响了对微生物的破碎程度,所以只适用于对瘤胃微生物小范围内的研究。珠磨-CTAB法鉴于有些瘤胃微生物细胞壁结构特殊且较难裂解,以玻璃珠机械破壁为主,使用CTAB相结合来裂解消化细胞,兼顾大多数瘤胃微生物特性。在利用玻璃珠震荡样品时,需注意震荡时间不宜过长,如果震荡时间过长,会导致提取的DNA断裂成更多的片段,影响后续的试验研究。在试验的操作过程中应尽量避免污染,使获得的基因组DNA能够代表瘤胃微生物而不被其他来源的DNA干扰。4pcr和布署对瘤胃细菌和古细菌的16srdna片段的检测本试验对常用的提取瘤胃微生物基因组DNA的方法进行了综合比较。从DNA提取的效果看,珠磨-CTAB法可以获得比较完整的瘤胃微生物总DNA片段。同时对样品中提取的DNA进行微生物16SrDNA的PCR扩增分析证明了该方法获得很好的效果,可以成功的扩增出瘤胃细菌和古细菌的16SrDNA片段。因此可以说明珠磨-CTAB法的适用性达到了分子生物操作的要求。瘤胃内容物取自装有永久性瘤胃瘘管的荷斯坦奶牛。高速台式离心机、电热恒温水