黄芪不同提取成分体外冲击波碎石术致肾损伤的实验研究

黄芪不同提取成分体外冲击波碎石术致肾损伤的实验研究

外科手术（eswl）是gas诉讼治疗史上的一个进步。然而，随着应用的增多，越来越多的科学家开始关注波浪引起的肾脏损伤，并寻求有效的预防措施。我们在前期研究中已证实黄芪能有效减轻ESWL对肾脏的损伤,作用优于公认的抗冲击波损伤药物异博定。本研究进一步探讨黄芪3种主要提取成分:黄芪总皂甙、总黄酮、总多糖在冲击波损伤肾脏中的作用及机制。材料和方法一、药物、试剂与仪器健康雄性家兔64只,体重1.8~2.3kg,由西安交通大学医学院动物实验中心提供。黄芪总皂甙、总黄酮、总多糖由西安交通大学天然药化研究所提取并鉴定。内皮素(ET-1)放射免疫试剂盒购自解放军总医院放射免疫研究所,丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)及蛋白定量试剂盒购自南京建成生物工程研究所。7231分光光度计(上海分析仪器厂),MZESWL-Ⅴ型碎石机(深圳慧康公司),H-600透射式电子显微镜(日本日立公司),超薄切片机(瑞典LKB公司)。二、肾组织匀浆在g组患者治疗前后功能性状的变化1.动物分组及用药剂量:所有动物随机分为:生理盐水对照组(简称对照组)、黄芪总皂甙组、黄芪总黄酮组、黄芪总多糖组(分别简称为:皂甙组、黄酮组、多糖组),每组各16只。各黄芪成分处理组家兔于ESWL前3d至后4d共7d,每天分别灌胃黄芪总皂甙150mg/kg、总黄酮50mg/kg、总多糖500mg/kg(均稀释成20ml),剂量按生药用量10g/kg折算。对照组家兔以等体积生理盐水灌胃。2.建立ESWL肾损伤模型:各组家兔冲击前用2%硫贲妥钠45mg/kg腹腔注射麻醉,麻醉良好后右侧卧位固定于MZESWL-Ⅴ型碎石机,B超定位F2于右肾,电压18kv,冲击1500次建立肾损伤模型。3.测定血及肾组织匀浆中损伤及保护相关因子含量:于冲击前、冲击后即刻、24h、72h、1周、2周抽取耳正中动脉血,分别置于3个试管中:(1)加有抑肽酶40μl、10%依地酸二钠30μl;(2)加有50U/ml肝素40μl;(3)空白试管。离心10min(空白试管样本离心前37℃水浴1h)取上清-70℃冰箱保存,测定血浆ET-1、NO及血清MDA含量。于冲击后24h、72h、1周、2周分别处死2、5、5、4只家兔,取右侧肾组织0.5g立即加入4℃生理盐水4.5ml冰水浴中碾磨,制成10%肾组织匀浆,离心10min取上清,分别检测组织匀浆ET-1、MDA、和NO含量,同时取对侧未受冲击肾脏用于对照。具体操作步骤及计算公式依照说明书进行。4.观察肾脏组织形态及细胞超微结构:取出肾脏后,部分用4%甲醛固定,置备石蜡切片,HE染色光镜下观察组织形态学改变。部分切成1mm3小块置于2.5%戊二醛固定液中4℃固定2h,0.1mol磷酸缓冲液浸洗30min,1%四氧化锇固定液4℃后固定2h,乙醇梯度脱水,环氧树脂EPON812浸透、包埋,聚合后作半超薄切片1~2μm。美蓝染色后光学显微镜下定位,超薄切片机切片50~70nm,醋酸铀、柠檬酸铅染色后,观察、拍照。5.统计学方法:所有实验数据符合正态分布,以均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示。采用SPSS11.0统计软件单因素方差分析,比较各黄芪成分组与对照组及各组冲击前后指标差异。电镜检测大鼠mda的能力1.ESWL后各组血浆ET-1与血清MDA的变化如表1:冲击后对照组ET-1、MDA呈明显上升趋势,分别于1、3d升至峰值,1周后恢复。3个黄芪成分组ET-1、MDA的上升幅度均显著低于同期对照组(P<0.05),其中总皂苷对血浆ET-1,总黄酮对血清MDA的抑制作用尤为显著,以上指标冲击前后无明显变化。2.各组ESWL后肾组织匀浆ET-1与MDA的变化见表2。冲击后3d对照组肾组织匀浆ET-1、MDA的含量显著高于正常水平(P<0.05),分别于1周、2周后恢复。总皂甙组ET-1、MDA均明显低于同期对照组(P<0.05),且与正常水平无显著差异。总黄酮组的变化与皂甙组相似,但对ET-1的抑制作用不如皂甙。多糖组ET-1的变化与黄酮组相似,对MDA的抑制作用不如皂甙与黄酮。3.各组冲击后血浆NO均呈明显下降趋势,其中对照组降幅最显著,于冲击后即刻降至谷底,1周后恢复到冲击前水平,而其肾组织匀浆NO含量直至冲击后2周仍明显低于正常(P<0.05)。总皂甙组血及肾组织匀浆NO水平均显著高于同期各组(P<0.05),总黄酮组NO呈波动性降低,冲击后1d时恢复,但3d后再次下降,而总多糖组各期NO水平与对照组相比均无明显差异(表3)。4.肾脏形态学的改变:ESWL后24h光镜下可见对照组肾小球囊腔缩窄、充血,小球内细胞肿胀、表14组大鼠冲击波碎石前后血浆ET-1及血清MDA的变化(x¯±s)(x¯±s)坏死,出现有核碎屑;72h后部分毛细血管球与局部球囊壁粘连,系膜细胞明显增生。各时段均可见肾小管上皮细胞不同程度变性、坏死,部分小管萎缩偶见管型。肾间质小动脉壁增厚、纤维化并出现大量以淋巴细胞为主的炎细胞浸润。2周后肾小管损伤及炎细胞浸润程度逐渐减轻,但肾小球病变仍无好转甚至出现部分小球硬化。皂甙组病变程度显著轻于对照组,肾小球及小管结构基本清晰,未见明显损伤,系膜细胞增生程度显著减轻,间质内炎细胞数量明显减少,且1周后基本消失。黄酮组的变化与皂甙组相似,多糖组肾间质炎细胞的浸润程度重于各组,其余病变与对照组相似(图1)。5.细胞超微结构的变化:ESWL后电镜下见对照组肾小球基底膜厚薄不均,足细胞变性、坏死,足突排列紊乱部分融合;肾小管纹状缘结构不清,线粒体肿胀、嵴消失,管腔内出现大量脱落的绒毛及细胞碎片。皂甙组的变化显著轻于对照组,肾小球基底膜连续均匀,足突排列有序整齐,小管纹状缘结构清晰,各细胞器无明显损伤。黄酮组远曲小管线粒体及肾小球基底膜的损伤程度稍重,其余与皂甙组相似。多糖组的变化与对照组相似(图2~4)。抗波浪损伤作用的比较ESWL是目前临床上治疗尿路结石的一种较安全而有效的手段,但其对肾脏的损伤也不容忽视。尤其当肾脏处于病理状态时,发生包膜下血肿、高血压等严重并发症的危险更随之增加。因此越来越多的学者开始关注损伤的确切机制以寻求有效的保护措施。目前认为除冲击能量的直接作用外,冲击波对肾脏的生物学损伤主要与自由基的大量释放及肾脏血流灌注的持续降低有关。在不断改良碎石机的同时,研究者陆续发现一些药物如钙通道阻断剂、甘露醇、硒元素等对减轻ESWL对肾脏的损伤有一定效果。黄芪是传统中医治疗肾脏疾病的常用药物,现代药理学研究表明黄芪及其成分对不同类型的肾脏病变都有确切的保护作用。其机制涉及对蛋白及脂质代谢紊乱的矫正,抑制单核-巨噬细胞局部浸润,阻断生长转化因子、骨桥蛋白的过度表达,改善血液流变特性,抑制自由基等多方面。在前期研究中我们发现黄芪能明显降低ESWL后局部及循环自由基活性,减轻肾实质细胞的损伤程度,作用优于常用的抗冲击波损伤药物异搏定。为进一步阐明黄芪发挥保护作用的确切成分,开发有效的抗冲击波损伤药物,本研究对3种黄芪主要提取成分黄芪总皂甙、总黄酮、总多糖在ESWL损伤肾脏中的作用及机制进行探讨。自由基对细胞膜脂质结构的过氧化反应是ESWL损伤肾脏的重要原因,黄芪单药已被证实具有强大的自由基清除能力。本研究进一步发现3种黄芪提取成分均能不同程度抑制ESWL后血及肾组织匀浆MDA的升高,其中黄酮与皂甙作用尤为显著。MDA作为脂质降解产物间接反映了机体受自由基攻击的程度,可见3种黄芪提取成分均具备抗过氧化损伤的能力,其中黄芪总皂苷与总黄酮作用更加突出,它们是黄芪抗自由基氧化损伤的最主要成分。肾脏血流灌注的持续降低是ESWL损伤肾脏的又一主要机制,血流动力的变化受局部和全身体液因素的调控,ET-1是目前已知最强的缩血管活性因子,肾脏中含有丰富的ET-1受体,对其敏感性远大于其他器官。NO对舒张血管平滑肌,提高肾小球滤过系数具有显著作用,尤其对入球小动脉更加敏感,因此更有利于灌注压的维持。试验中总皂甙组血及肾组织匀浆ET-1水平均较对照组显著降低而NO仅在冲击后即刻出现短暂下降,24h后即恢复正常,这表明黄芪总皂甙通过对血管活性因子ET-1、NO的调控,显著改善冲击波引发的肾血流量下降,从而减轻组织细胞的缺血缺氧程度。黄酮与多糖也能一定程度抑制ET-1的升高,但作用不如皂甙,二者对抑制NO下降无明显作用。这说明黄芪总皂甙是黄芪改善ESWL后血流动力学紊乱,维持肾组织血液灌注的主要活性成分。有研究认为冲击波引起肾脏的某些病理改变与高血压等远期并发症的发生密切相关。本研究发现ESWL后对照组肾小球囊腔狭窄,系膜细胞增生,间质小血管硬化并有大量淋巴细胞浸润,2周后无明显好转,说明肾脏的病理损伤可能存在一个较长期的过程,至于上述病变是否与高血压的发生存在联系还需更长时间的观察。黄芪总皂苷组与黄酮组无论光镜下肾脏形态还是电镜下细胞超微结构的损伤程度