肾安提取液对糖尿病肾病小鼠肾脏的影响

肾安提取液对糖尿病肾病小鼠肾脏的影响

糖尿病性肾衰竭（dn）是糖尿病最常见的并发症。晚期糖基化终产物(AGEs)是体内蛋白质与糖在无酶条件下发生反应后的产物。AGEs浓度的升高与糖尿病及其并发症密切相关,糖基化终产物途径被认为是糖尿病肾病的重要病理机制。本实验观察肾安提取液对糖尿病肾病模型小鼠肾脏AGEs、RAGEs的影响。1材料和方法1.1动物8周龄C57BL/6小鼠54只(购自湖南斯莱克景达实验公司,实验动物合格证号:SCXK(湘)2009-0004)。1.2博维sybr肾安提取液(黄芪甲苷、淫羊藿苷、1,8二羟基蒽醌组方比例为2.5∶1.8∶2.8),用0.3%羧甲基纤维素钠配制成0.3029mg/mL备用;厄贝沙坦(安博维,由杭州赛诺菲圣德拉堡民生制药有限公司生产,批号:1812);链脲佐菌素(STZ,购自Sigma公司)。Trizol(Invitrogen公司);逆转录试剂盒(TOYOBO,日本);SYBRGreenrealtimePCRmastermix(TOYOBO,日本);免疫组化一抗为兔抗小鼠RAGE多克隆抗体(Santacruz公司);二抗为辣根酶(HRP)标记山羊抗兔IgG(KPL公司);两步法抗兔/鼠通用型免疫组化试剂盒(GENETECH公司)。1.3彩色图像系统Real-timePCRDetectionSystem(SLAN,HONGSHI公司);HMIAS2000高清晰度彩色病理图文分析系统(武汉千屏影象技术公司);RF-5000荧光分光光度计(日本岛津公司)。1.4糖尿病模型成功制备随机将54只小鼠分为6组,每组9只:正常对照组(N组)、DN模型组(DN组)、厄贝沙坦组(EB组)、肾安高剂量组(SAG组)、肾安中剂量组(SAZ组)、肾安低剂量组(SAD组)。造模方法:适应性喂养1周后,禁食12h,将STZ溶解于pH4.8柠檬酸缓冲液中,按150mg/kg腹腔内一次性注射,同时正常对照组腹腔注射等量无菌柠檬酸缓冲液。注药后72h尾尖取血,测血糖(ACCU-CHEK血糖仪,罗氏公司),血糖>16.17mmol/L者确定为糖尿病诱导成功,此后监测血糖和24h尿蛋白,持续出现蛋白尿的小鼠视为DN模型成功。造模成功后进行药物干预。正常对照组、DN模型组小鼠灌服蒸馏水10mL/kg;EB组灌服厄贝沙坦10mg/kg(蒸馏水稀释至10mL);肾安大剂量为9.088mg/kg,中剂量为4.544mg/kg,小剂量为2.272mg/kg,均采用灌服法。药物干预时间为4周。1.5样品采集药物干预结束后用2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,取左肾用4%多聚甲醛固定,用于病理切片,右肾-70℃冰箱冻存备用。1.6观察指标1.6.1荧光强度的测定将肾皮质200mg剪碎(冷冻),匀浆,4℃6500r/min离心30min,去上清,沉淀中加氯仿-甲醇(2∶1)去脂,加入1mL甲醇、250μL水,水化,自然沉淀,4℃6500r/min离心30min,去上清液,加入氯仿1μL、甲苯1μL以抑制细菌生长,同时以含Ⅶ型胶原酶的0.1mol/LCaCl2缓冲液作空白对照,37℃轻摇24h,然后4℃8000r/min离心5min,取上清液备用;上清液用荧光分光度计按370/440nm(激发波/发射波)测定荧光值;以0.1mol/LCaCl2缓冲液荧光值为1个任意荧光单位(AUF),样品荧光强度依此折算;肾皮质中蛋白质含量的测定采用Bradfrod的方法,用1g/L的牛血清白蛋白绘制蛋白标准曲线,肾皮质中AGEs含量以AUF/mg表示。1.6.2rages的pcr检测①引物的设计:根据Genebank中小鼠和actin序列,设计上、下游引物,RAGEs引物:5′-CCGATGGCAAAGAAACACTC-3′,引物2:5′-CTATTCCACCTTCAGGCTCAAC-3′,扩增产物长246bp;actin引物1:5′-CCGTGAAAAGATGACCCAG-3′,引物2:5′-TAGCCACGCTCGGTCAGG-3′,扩增产物长249bp。②总RNA的提取:参考说明书用Trizol试剂提取。③逆转录:采用逆转录试剂盒,以提取的组织总RNA为模板,以Oligo-dT为引物进行逆转录反应。将组织中提取的总RNA8μL、Oligo(dT)201μL、无核酸酶水3μL、5×RTBuffer4μL、dNTP2μL、RNA酶抑制剂1μL、RNA逆转录酶1μL依次加入Dorf管内,混合均匀,使总体积为20μL。设置PCR仪程序为:42℃20min,95℃5min,4℃5min。反应完成后总RNA已逆转录为cDNA,产物即为PCR反应的模板。④扩增:RAGEs的扩增体系:SYBRGreenmix12.5μL,引物(5pmol/μL)2μL,ddH2O8μL,cDNA(10倍稀释)2.5μL,扩增条件:50℃2min、94℃5min预变性;94℃30s、59℃30s、72℃1min,循环设置数为40;终末延伸72℃7min。1.6.3木本糖液显色显色法石蜡切片置于65℃烘箱中,烘片2h,脱蜡至水。微波修复,切片放入3%过氧化氢溶液,室温下孵育10min,以阻断内源性过氧化物酶。一抗抗体按1∶150稀释,每张切片加入50μL稀释液,4℃孵育过夜。每张切片加80μLA液(ChemMateTMEnVision+/HRP),室温下孵育45min。每张切片加80μL新鲜配制的DAB溶液,室温下孵育5min,显微镜控制显色。显色完全后,苏木素复染,梯度酒精(70%-100%)脱水干燥,二甲苯透明,中性树胶封固。每张肾脏切片随机选取肾皮质10个高倍镜视野(200倍),用HMIAS2000高清晰度彩色病理图文分析系统分析各组小鼠肾皮质RAGEs的平均阳性表达率。1.7统计方法实验资料用均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示,组间比较采用t检验,结果用SPSS17.0统计软件包处理。2结果2.1各组肾安对脏器ragesmrna、rages蛋白表达的影响DN组肾脏RAGEsmRNA、RAGEs蛋白的表达明显高于N组(P<0.01),EB组、肾安各剂量组肾脏RAGEsmRNA、RAGEs蛋白表达较DN组显著降低(P<0.05或P<0.01)。见表1、图1。2.2eb组、肾安各剂量对肾安各剂量肾安各剂量对肾ags含量的影响DN组肾脏AGEs含量明显高于N组(P<0.01),EB组、肾安各剂量组肾脏AGEs含量较DN组显著降低(P<0.05或P<0.01)。见表2。3肾安提取液对dn肾组织rages表达的影响目前学者认为AGEs途径是介导肾脏损伤中最主要的途径之一。许多实验也证明应用ACEI、ARB均可以使糖尿病肾病肾脏AGEs聚积减少,体外实验也证明AGEs可激活RAS的许多成分,包括ACE、AT1受体等。应用ACEI、ARB可以延缓慢性肾脏病的进展,但是GFR仍然持续下降,提示DN时是否激活了其他途径,也为联合应用RAS阻滞剂和AGEs抑制剂提供了合理前提。糖尿病患者体内存在高糖环境,葡萄糖或其他还原糖与蛋白质的末端氨基酸或ε氨基酸反应,可以形成蛋白质非酶糖基化反应的终产物。AGEs可以与其它蛋白质、核酸大分子物质以及脂类形成巨交联物,从而成为脂褐素的基本成分。脂褐素被溶酶体吞噬后,在细胞内堆积,干扰了细胞正常代谢,影响细胞功能并能产生细胞毒性作用,加速细胞老化进程。AGEs与其特异性受体结合而被细胞内呑清除,或者诱导细胞的氧化应激、激活NF-κB增加应激细胞因子的表达、参与凋亡过程等,从而引发一系列代谢紊乱,在糖尿病肾病的发病中发挥重要作用。AGEs能明显诱导大鼠肾皮质cTGFmRNA和蛋白质表达增强,并使ECM蛋白成分合成增多。AGEs可能通过诱导cTGF表达上调引起EMC合成增多。AGEs能明显诱导大鼠肾系膜细胞CTGFmRNA的表达,提示AGEs可能通过上调CTGFmRNA的表达引起ECM积聚。人类和其他种属动物的不同细胞表面存在有多种AGEs受体,其中RAGEs是目前研究的较为深入的一种AGEs受体,RAGEs属免疫球蛋白超家族成员,可广泛表达于血管平滑肌细胞、单核巨噬细胞、内皮细胞、肾小球系膜细胞和神经细胞表面。RAGEs作为AGE的信号转导受体,具有多种不同的生物效应。RAGEs可以介导激活NF-κB而促进靶基因的表达、促炎细胞因子的分泌而参与各种炎症病理过程;RAGEs还可以通过增强粘附分子、基质金属蛋白酶-9等的表达,增加损伤部位炎症,导致内皮细胞功能失调等,促进动脉粥样硬化的发展。RAGEs能够激活内皮细胞和单核细胞的NADPH氧化酶,诱导氧化应激产生大量活性氧而损伤组织细胞等。研究显示,在DM患者血管壁及肾脏,RAGEs的表达与正常人相比显著增加。在肾脏,AGEs与RAGEs结合后可通过产生氧化应激,诱导血小板衍化生长因子、转化生长因子的表达,促进细胞外基质的产生,增加血管通透性,使血液处于高凝状态等机制参与DN的进展。AGEs可通过RAGEs介导肾小管上皮细胞向肌纤维原细胞的转化,促进糖尿病肾小管间质的硬化。用RAGEs抗体或sRAGE阻断AGEs与RAGEs的结合可显著延缓DM大鼠血管病变的发生、发展。长期应用sRAGE或抗RAGEs抗体可明显缓解db/db糖尿病大鼠肾脏损害。中药可以抑制DN肾脏糖基化终产物对肾脏得损害作用。肾康丸对DN肾脏有保护作用,其机制可能与其降低DN大鼠血清、肾组织AGEs水平以及肾组织RAGEs含量,抑制肾组织RAGEsmRNA的表达有关。枸杞多糖可以降低模型大鼠糖基化终产物的产生,减少肾脏IL-8的分泌,从而预防糖尿病肾病的发生。肾安提取液是在多年临床经验基础上总结出的治疗糖尿病肾病的有效方,由大黄、黄芪、淫羊藿组成,我们既往的实验研究发现,大黄蒽醌、黄芪甲苷、淫羊藿苷是其中的主要成分。大黄酸可以抑制TGF-β诱导的肾小球系膜细胞的增生、肥大以及ECM的产生,还可以明显抑制TGF-β所介导的系膜细胞GLUT1表达与细胞对葡萄糖的异常摄入。洪小平等发现黄芪可通过多种途径在基因水平上起到对糖尿病肾病的保护作用,对物质代谢相关基因影响更为明显。淫羊藿能减少代谢废物的蓄积,降低大鼠血清胆固醇、甘油三酯,具有抑制肾小球肥大及补体C3、纤维连接蛋白在肾小球毛细血管袢的沉积,减少细胞外基质的产生的作用。本研究发现,肾安提取液能降低肾组织AGEs含量,抑制糖尿病肾病模型小鼠肾皮质RAGEsmRNA和RAGEs的表达,对DN模型鼠肾脏有保护作用。肾安提取液对C57BL/6DN模型小鼠肾脏的保护作用与药物剂量有一定关系,肾安提取液高、中、低剂量均能显著降低模型鼠肾皮质RAGE