奶牛体内金属硫蛋白的富集与分布

奶牛体内金属硫蛋白的富集与分布

金属硫蛋白（mt）广泛存在于各种动物组织和器官中，其功能结合了蛋白质和天然生物活性物质。它具有重要的生物学和生物学功能。在机体微量元素代谢平衡、重金属解毒、清除自由基、抗应激、抗辐射、增强免疫力和延缓生殖衰老等方面均具有重要作用,因而受到了国内外学者的广泛重视,并取得了一些令人嘱目的成果,为MT的研究和应用展示了广阔的前景。但MT在畜禽体内代谢规律的研究却鲜见报道。而开展MT在畜禽体内代谢规律研究,对全面认识和充分发挥MT各种生物学功能,促进动物健康,提高畜禽生产性能及产品质量,保证人类健康和环境安全均具有重要意义,显得十分重要和紧迫。研究MT在奶牛公犊体内的吸收速率、代谢过程、排泄途径以及在各组织器官中的存留分布规律,以期为MT的深入研究及其在提高家畜生产力以及生产优质安全畜产品中的应用提供科学依据。1材料和方法1.1材料表面1.1.1牛奶公身份肝脏锌金属硫蛋白的纯化金属硫蛋白系本实验室诱导合成、分离和纯化的奶牛公犊肝脏锌金属硫蛋白(Zn-MT)。Na125I来自中国原子能研究院(100mCi)。1.1.2蛋白混合成分配比的确定参照本实验室的方法制备:取N-琥珀酰胺-3-(2-吡啶-二硫)-丙酸酯的苯溶液2mL(100mg/L),加入Iodogen100μg,氮气吹干,加水0.5mL,加125I溶液35mCi,反应5min,加入5%的偏重亚硫酸钠溶液0.2mL终止反应,用氯仿萃取反应物4次,每次1mL,合并氯仿相,氮气吹干,加入1mL的MT溶液(蛋白含量为15g/L),于4℃冰箱中反应6h,用LH-20分离(层析柱:1cm×20cm),分部收集。经测定后收集蛋白部分流出液。标记物放化纯度:98%;标记率:75%;标记物放射性比度:1.7mCi/mg。制作成胶囊,125I每粒1mCi,125I标记MT(125I-MT)每4粒1mCi。1.2方法1.2.1血样、尿样的采集选用健康的中国黑白花奶牛初生公犊12头(平均体重40kg左右),随机分成对照组和试验组,每组6头。试验前预试4d,每日饲喂3次,每头日喂7.5kg牛奶。第5天进入正式试验期。对照组每头灌喂Na125I1mCi,试验组每头灌喂125I-MT1mCi。分别在灌喂后第1,2,3,5,7,9,11,12,14,16,18,24和48h逐头经颈静脉采取血样5mL;在灌喂后第1,3,5,7,9,13,17,21,25,29,33,37,41和45h按全收粪法收集粪、尿样。在灌喂后48h屠宰取肝、肺、肾、心、脾、小肠、大肠、真胃、皮、肌肉、骨等组织和脏器样,并且同时取各样品平行样5份进行放射性γ计数。1.2.2mt在牛体内的泄漏动态和留置服务量取不同时间点采取的血液和尿样各1mL、粪和组织器官样各1g,用GC-300全自动γ计数仪进行放射性γ计数,通过对不同时间点血液、粪和尿样中125I的测定推算出MT在牛体内的排泄动态;并测定牛组织器官中MT的存留量。计算公式为:居里数(mCi)=放射性记数÷0.75÷(2.22×109)式中,0.75为标记效率。MT量=居里数÷放射性活度比,并且用间接竞争性ELISA法对MT量进行校验。1.3处理数据采用SAS(6.12)统计软件对数据进行分析处理。2结果与分析2.1灌喂抗过血指标在对照组和试验组牛只分别灌喂Na125I和125I-MT后48h内各时间点血液中放射性活度动态变化见表1。碘在对照组牛体内吸收较快,在灌喂125I后血液中放射性活度快速上升,灌喂后1h即达最大值(1.0428×10-2mCi),2h后逐渐下降,放射性碘在血液中半衰期为12.5h(表1)。试验组在灌喂125I-MT后,血液中放射性活度缓慢上升,在灌喂后11h达最大值(0.6235×10-2mCi),血液中清除半衰期为36.8h,然后缓慢下降。除灌喂后7,9,11,12和48h等时间段外,试验组牛只血液中放射性活度与对照组相比均差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01),具体表现为5h之前显著低于对照组,14h之后显著高于对照组。由此可见,MT在奶牛公犊体内消化、吸收较缓慢。2.2牛粪中产品中放射性活度的变化对照组牛只灌喂后1h可以在粪中开始检测到125I,以后粪中125I的浓度缓慢上升,29h达到峰值(0.7740×10-2mCi)(表2),随后粪中125I的浓度快速下降,粪中的125I浓度较低,说明碘消化吸收较完全,并且粪中内源性碘排出量不大。试验组在灌喂后3h才开始从粪中检测到125I-MT,以后粪中125I-MT浓度逐渐升高,33h达最大值(6.4673×10-2mCi),125I-MT在粪中排出时间主要集中在29~37h这一时间段,37h后粪中浓度便快速下降,可见MT在牛体内大量滞留时间为37h左右;并且,由MT在粪中排出的时间集中在灌喂后29~37h,可初步推断牛粪中排出的MT主要是在肠道中未吸收完的MT,而并非内源性MT。试验组牛粪中放射性活度除了在1和3h两个时间点显著低于对照组外,其余各时间段均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)地高于对照组(表2),说明125I-MT从牛粪中排出量明显大于125I。从总的情况看,对照组牛粪中125I的排出率(即排出量占灌喂总量的百分比)仅为3.0907%,而试验组牛粪中125I-MT的排出率为24.1776%,两者差异极显著(P<0.01)。说明MT在牛体内消化吸收不完全,从粪中排出是牛MT排泄的重要途径。2.3灌喂na125i前后尿中放射性活度的比较试验组在灌喂后1h便可在尿中检测出125I-MT,随后尿中125I-MT浓度逐渐升高,在灌喂后21h尿中放射性活度达最大值(6.1845×10-2mCi),此后迅速下降(表3)。对照组在灌喂Na125I后1h也可从尿中检测出I,随后尿中125I的浓度逐渐升高,在灌喂后13h尿中浓度达最大值(9.1583×10-2mCi),此后逐渐下降。就2组比较而言,试验组在处理全期各时间段(21h除外)尿中放射性活度均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)地低于对照组;从各组尿中放射性总活度占灌喂总活度的百分比看,对照组尿中排出125I的量占灌喂总量的65.2413%,极显著(P<0.01)地高于试验组尿中排出MT量占灌喂总量的百分比(31.7460%)。说明125I大部分从尿中排出;尿是牛MT排泄的主要途径之一;这也进一步说明MT在牛体内消化吸收不完全。2.4mt在组织器官中的残留情况对照组牛只组织器官中125I放射性活度和125I的存留率以及试验组牛只组织器官中125I-MT放射性活度、125I-MT的存留率和MT含量在多数组织器官间具有显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)的差异(表4和5)。125I在组织器官中的放射性活度由大到小依次为:肝>真胃>肾>肌肉>皮>小肠>大肠>肺>心>脾>骨;肌肉中125I的存留率(即存留量占灌喂总量的百分比)最高,达3.9793%,其余依次是肝脏、皮、小肠、骨、真胃、大肠、肾、肺、心和脾。试验组125I-MT在组织器官中放射性活度(表5)依次为:肝>脾>肌肉>皮>大肠>小肠>肾>肺>真胃>心>骨;125I-MT在各组织器官中的存留率大小依次为:肌肉、肝、皮、骨、小肠、大肠、真胃、肺、心、肾和脾;MT在各组织器官中的含量高低则依次为:心、肝、肺、脾、大肠、真胃、小肠、肾、皮、肌肉和骨。说明MT主要存留在肌肉、肝脏和皮中,其次富集在小肠、大肠、真胃和肝,MT在牛上述各组织器官中总的存留率为7.9854%;就MT在牛各组织器官中的含量而言,以心、肝、肺、脾等器官最高,大肠、真胃、小肠、肾等器官次之,皮、肌肉和骨等组织最低。3讨论3.1肠道组织病理学检测随着近代生物科学技术的迅猛发展,生物活性物质的发现、研究及其应用备受关注。作为一种具有重要生理学和生物学功能的天然生物活性物质,MT在动物体内的吸收方式成为近年来研究的热点。研究指出:MT能在小鼠真胃肠道内被完整吸收,并且以完整的MT形式转运到体组织。李丽立等报道,放射性125I大部分在甲状腺富集,小部分被蛋白络合,而与蛋白结合碘不能被甲状腺摄取。125I-MT在灌喂后的消化过程中没有被分解出125I,仍以125I-MT结合形式在消化道内被吸收,并被转运到体内各组织器官。因而通过检测125I的量能直接反应出MT的量。这说明MT在动物消化道内吸收方式有别于其他蛋白,MT抗酸、抗碱、抗酶解以及分子量小等特性使其能够在胃肠道内被完整吸收,并没有被分解成单个的氨基酸,也说明采用检测125I的活度来确定MT的量是完全可行的,而且,用此方法还可以排除内源性MT对研究结果的干扰。3.2mt的不同动物和不同本研究表明,试验组牛只在灌喂125I-MT后,血液中放射性活度缓慢上升,在灌喂后11h达最大值(0.6235×10-2mCi),然后缓慢下降。试验组牛只血液中放射性活度与灌喂125I的对照组牛只血液中放射性活度相比,灌喂后的前5h显著(P<0.05或P<0.01)低于对照组,14h之后显著(P<0.05或P<0.01)高于对照组。由此可见,MT在奶牛公犊体内消化、吸收较缓慢。MT在血液中具有一定的半衰期,不同动物MT的半衰期不同。研究指出,绵羊MT的半衰期大约为22~24d,鸡MT的半衰期为36h;小白鼠血液中MT清除半衰期为15.3h;杜长大三元杂交猪血液中MT清除半衰期为22.6h。本研究结果表明,经灌喂后的MT在奶牛公犊血液中的清除半衰期为36.8h。尽管这方面的报道不多,但从仅有的研究资料仍然可以看出:MT在各种动物体内清除速率差异十分显著。因此,在研究和应用MT时,应充分考虑MT在各动物体内吸收特征、代谢动态和清除速率,否则将难以达到预期效果甚至造成不必要的浪费。3.3mt的排泄量MT在体内的吸收、排泄涉及许多生理过程,其中包括体内必需金属元素的储存、代谢和转运,重金属的解毒。本研究表明,奶牛公犊MT主要从尿中排出,其次是从粪中排出。牛尿中排出MT量占灌喂总量的31.7460%,粪中的排泄量占总灌喂量的24.1776%;MT从奶牛公犊体内排出时间相对集中于灌喂后29~37h,滞留时间较长(37h左右)。MT排泄规律表明,MT在牛体内消化吸收不完全。由于MT消化率较低,并且在消化道内滞留时间较长,饲粮中过量的矿物质能够在消化道内与MT结合,从而可以减缓矿物质的吸收速度,使采食后血液和组织器官内矿物质的含量不会骤然上升。当机体组织缺乏某一矿物质时,MT能够释放出该矿物质供机体需要。由此可见,MT在消化道内能够对矿物质起到缓释作用,能够促进机体对矿物质的充分利用,减少矿物质的排泄量,从而可有效发挥节约饲料资源和防止生态环境污染的重要作用。3.4mt在不同组织器官中的残留探明MT在机体各个组织器官中的存留和分布,将为MT的进一步研究和应用提供重要依据。本研究发现,试验组牛只组织器官125I-MT的存留率以及MT含量在多数组织器官间具有显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)的差异。125I-MT在牛各组织器官中总存留量大小依次为:肌肉、肝、皮、骨、小肠、大肠、真胃、肺、心、肾和脾,说明MT主要存留在牛的肌肉、肝脏和皮中,这是因为肌肉和皮肤占牛胴体的比例大而肝脏中MT含量高的缘故。MT在各组织器官中的含量高低则依次为:心、肝、肺、脾、大肠、真胃、小肠、肾、皮、肌肉和骨,即MT含量在牛的心、肝、