冷贮对米蛾卵繁育螟黄赤眼蜂的影响

冷贮对米蛾卵繁育螟黄赤眼蜂的影响

彩绘蜜蜂tichogrammaspp是目前世界上最广泛使用的繁殖和释放的寄生虫（kp，1993）。米蛾Corcyracephalonica卵繁殖的螟黄赤眼蜂Trichogrammachilonis是我国重要的生防产品,应用于防治多种鳞翅目害虫(刘志诚等,2000)。作为一种大面积释放的天敌,在特定时期需要大量的寄生蜂(Li,1994),冷贮赤眼蜂能积累多次繁殖的种蜂,从而满足大量生产的需要;其次,冷贮能调整多批繁殖的赤眼蜂释放时在同一时期羽化。所以,赤眼蜂冷贮的相关研究有助于实现和推动其商品化生产、运输和释放应用,并可据此设计赤眼蜂的周年生产流程,增加生产用蜂的积累,降低规模化繁蜂的成本。目前螟黄赤眼蜂直接冷贮是在2～5℃的环境下进行的(吐尔逊等,2005;潘雪红等,2011),冷贮25d羽化率低于50%,冷贮不宜超过20d(潘雪红等,2011),存在冷贮期过短和冷贮后羽化率下降甚至无法羽化等问题,丧失赤眼蜂商品价值,直接影响了田间害虫防治和大规模生产工作。因此,冷贮米蛾卵繁殖的螟黄赤眼蜂急需系统、深入的研究。为了全面评价冷贮对米蛾卵繁殖赤眼蜂的影响,本试验采用米蛾卵为寄主,以冷贮温度、冷贮虫龄和冷贮时间3个因素为试验因子,研究了冷贮对螟黄赤眼蜂活蛹率、羽化率和畸形率的影响,并进行了各因子相关分析,以期改进米蛾卵内螟黄赤眼蜂的冷贮方法,为赤眼蜂大量生产和田间应用技术提供理论依据。1材料和方法1.1心理型心肌病meg米蛾卵:用麦麸饲料饲养米蛾,每日收集米蛾卵,除去杂物后用40目的筛选器过筛,获得清洁、正常的米蛾卵。螟黄赤眼蜂:采自广东省湛江市甘蔗田间条螟ChilosacchariphagusBojer、二化螟ChiloinfuscatellusSnellen寄生卵,室内鉴定并在米蛾卵上饲养多代。冷库(两个温度:3±1℃和10±1℃;RH90%±5%),冰箱(National,NR-253TR-X,-20±1℃,RH40%),繁蜂室(25±1℃,RH75%±15%,14L:10D),无色透明玻璃管(1cm×8cm和3cm×8cm两种规格),培养皿(1cm×10cm),宽度1.10cm的双面胶。1.2试验设计和数据统计试验中考虑3个因素:(1)冷贮温度:3±1℃和10±1℃,在RH90%±5%,0L:24D的冷库内完成。(2)冷贮虫龄:1,2,3,4,5,6,7,8和9日龄9个虫龄。将接蜂后时间设置为虫龄,即在25±1℃条件下以接蜂开始为起点,赤眼蜂分别发育1,2,3,4,5,6,7,8和9d。9日龄有部分赤眼蜂羽化,但为了试验数据的系统完整,也同样进行了试验和数据统计。(3)冷贮时间:1,2,3和4周4个时间,均在当天11:00放入或取出。综合3个因素共72个处理组合,每个处理设置3个重复。对照:本试验需要设置平行对照,即1,2,3,4,5,6,7,8和9日龄的赤眼蜂在25±1℃,RH90%±5%,0L:24D的对照环境放置1,2,3和4周后,在25±1℃的繁蜂室内继续发育5d后统计活蛹率。羽化前将赤眼蜂寄生卵装入玻璃管(直径2cm,长8cm),用报纸和橡皮筋封口,竖直放置,待赤眼蜂全部羽化、死亡后,将卵、蜂混匀取样,镜检调查羽化数、未羽化数、成蜂数和畸形蜂数(蜂体、前后翅完全自然展开为展翅正常,其余视为畸形),统计羽化率和畸形率。简而言之对照组是接蜂后一直在25±1℃下发育直至蛹期、成虫羽化期,各虫龄所处的环境相同,且放置1周时赤眼蜂均发育至蛹期或成虫期,因此本试验设置的平行对照实际上是同一个对照,即接蜂后的螟黄赤眼蜂置于25±1℃,RH90%±5%,0L:24D的繁蜂室内继续发育,5d后统计活蛹率,全部羽化、死亡后统计羽化率和畸形率。因此经过上述分析,本试验活蛹率仅设置了上述1个对照,3个重复,每个重复样本量为寄生卵30mL。1.2.1不同温度对赤眼蜂活蛹率的影响收集24h内产出的米蛾卵,清除鳞片杂物,并在紫外灯下20cm处照射20min用于试验。母代赤眼蜂为未经冷贮的螟黄赤眼蜂,上午11:00时待母本蜂大量羽化时,以蜂卵比1:3的比例繁殖赤眼蜂4h,4h后脱去母本蜂,并清除子代米蛾卵上的所有成蜂,然后放入25±1℃,RH75%±15%,14L:10D的繁蜂室内继续发育。接蜂后第1,2,3,4,5,6,7,8和9天上午11:00时,分别在3±1℃的低温库、10±1℃中温库上述寄生卵30mL,共冷贮540mL寄生卵。待各日龄的赤眼蜂冷贮1,2,3和4周时,在相应的日期上午11:00时,取出5mL赤眼蜂放入直径为10cm的培养皿,在25±1℃,RH75%±15%,14L:10D的繁蜂室内继续发育5d后,记录黑色米蛾卵数和总米蛾卵数,统计赤眼蜂活蛹率。用米蛾卵繁殖赤眼蜂,当卵被赤眼蜂寄生并发育至预蛹时,米蛾卵表皮将变成黑色,因此本试验以米蛾卵变成黑色作为卵内赤眼蜂发育至活蛹的标志。螟黄赤眼蜂在米蛾上寄生时,90%以上为一卵一蜂,因此本试验以黑色米蛾卵数作为活蛹数的估量。本试验的活蛹率是赤眼蜂活蛹数占米蛾卵总数的比率,米蛾卵总数包括被寄生和未被寄生的米蛾卵数,因此本试验活蛹率是赤眼蜂卵孵化率、幼虫成活率和化蛹率的综合体现。1.2.2试验设计与程序羽化前将赤眼蜂装入玻璃管(直径2cm,长8cm),用报纸和橡皮筋封口,竖直放置,待赤眼蜂全部羽化、死亡后,将卵、蜂混匀取样,镜检调介羽化数、未羽化数、成蜂数和畸形蜂数(蜂体、前后翅完全自然展开为展翅正常,其余视为畸形),统计羽化率和畸形率。试验设置3个因素,即9个虫龄、2个冷贮温度和4个冷贮时间,共72个处理,每个处理设置3个重复。以接蜂后一直在25±1℃,RH75%±15%,14L:10D条件下发育至全部羽化为对照,统计时处理和对照都均匀取样并统计3次,每次不低于100头蜂。1.3平均值标准误以上数据用Excel进行数据统计和处理,用统计软件SPSS进行数据分析,方差分析之前用y=Inx进行数据转换。数值采用平均值±标准误(mean±SE)表示。对活蛹率、羽化率和畸形率数据(对照组数据除外)进行SPSS三因素(冷贮温度、冷贮虫龄和冷贮时间)有重复方差分析,并各因素的每一组合看作为一个处理,采用单因素方差分析(检验同一温度下各处理的差异)和Dunnett检验(检验处理数据是否显著低于对照),两两比较各处理间及与对照的活蛹率、羽化率和畸形率的差异显著性。2结果与分析2.1不同虫龄的螟黄赤眼蜂活蛹率本试验25℃下米蛾卵内的赤眼蜂接蜂后的第5天已发育至蛹期(陈科伟等,2002),本试验5-9日龄冷贮处理组的活蛹率是相同的,因而活蛹率只统计了虫龄1-5日龄的处理组。三因素方差分析结果表明,冷贮温度(F=156.78;n=40;P<0.01)、冷贮时间(F=5.24;n=40;P<0.01)和冷贮虫龄(F=331.44;n=40;P<0.01)均显著影响螟黄赤眼蜂的活蛹率(表1)。三因素间所有可能组合的交互作用也均显著影响螟黄赤眼蜂的活蛹率(P<0.05)。以米蛾卵繁殖的螟黄赤眼蜂在25±1℃下发育(对照组),活蛹率为77.99%。不同冷贮温度下,活蛹率均随着虫龄的增大而升高,且3±1℃下活蛹率升高更为显著(表2)。单因素方差分析表明,在10±1℃下,1和2日龄的螟黄赤眼蜂所有冷贮时间的活蛹率(42.81%～58.02%)均显著低于对照(77.99%)(P<0.01);在3±1±℃下,1,2和3日龄的螟黄赤眼蜂所有冷贮时间的活蛹率均显著低于对照(P<0.05)。总体来看,不同虫龄的螟黄赤眼蜂活蛹率在不同温度下表现不同。在10±1℃下,3-5日龄的螟黄赤眼蜂的活蛹率受冷贮的影响不显著,冷贮时间对活蛹率影响不显著;在3±1℃下,4和5日龄的螟黄赤眼蜂受冷贮的影响不显著,这些虫龄冷贮时,活蛹率不随冷贮时间的延长而下降;1-3日龄螟黄赤眼蜂的活蛹率随着冷贮时间的延长显著地下降,冷贮对较大虫龄(4和5日龄)螟黄赤眼蜂的活蛹率无显著影响(表2)。2.2不同虫龄的螟黄赤眼蜂冷贮24周的性能在3±1℃下,1日龄的螟黄赤眼蜂冷贮4周活蛹率仅有0.05%,变黑的米蛾卵极少,无法统计此处理的羽化率,因而无此处理数据。三因素方差分析结果表明,冷贮温度(F=375.27;n=71;P<0.01)、冷贮时间(F=476.50;n=71;P<0.01)和冷贮虫龄(F=124.36;n=71;P<0.01)均显著影响螟黄赤眼蜂的羽化率(表3)。三因素间所有可能组合的交互作用也均显著影响螟黄赤眼蜂的羽化率(P<0.05)。以米蛾卵繁殖的螟黄赤眼蜂在25±1℃下发育(对照组),羽化率为85.95%。在3±1和10±1℃低温下,羽化率均随着虫龄的增大呈现出先上升后下降的规律,且随着冷贮时间的延长而显著下降(表4)。单因素方差分析表明,在10±1℃下,6-9日龄的螟黄赤眼蜂冷贮2～4周,羽化率均显著低于对照(P<0.01);在3±1℃下受冷贮的影响更为显著,3日龄及以后虫龄冷贮时羽化率自冷贮2周起,开始大幅下降,降至46.86%～2.84%。除冷贮1周和2日龄冷贮2和3周之外,其他25个处理组合的羽化率均显著低于对照(P<0.05)。以上结果表明,由不同冷贮温度、冷贮虫龄和冷贮时间构成的冷贮环境大都可显著降低羽化率,短期冷贮(1周内)对羽化率的不利影响相对不显著。总体来看,不同虫龄螟黄赤眼蜂的羽化率表现不同。10±1℃下1-2日龄的螟黄赤眼蜂羽化率受冷贮时间的影响不显著,而6-9日龄的螟黄赤眼蜂羽化率均受显著影响;3±1℃下2日龄的螟黄赤眼蜂受冷贮时间影响小,3-9日龄的螟黄赤眼蜂羽化率均随冷贮时间的延长而显著降低,而且虫龄越大下降的越显著,特别是9日龄的螟黄赤眼蜂在10±1℃下,以及7,8和9日龄的赤眼蜂在3±1℃下,仅冷贮2周羽化率就下降到42.06±6.09%或者更低。不同温度下螟黄赤眼蜂羽化率表现不同,在10±1℃下2和3日龄的螟黄赤眼蜂的羽化率受冷贮影响最小,冷贮4周仍有75%左右的羽化率;而在3±℃下2日龄的螟黄赤眼蜂的羽化率受冷贮影响最小,冷贮3周仍有78.54%±1.77%的羽化率。整体上看,相同虫龄的螟黄赤眼蜂随着冷贮时间的延长,3±1℃下螟黄赤眼蜂的羽化率下降的比10±1℃的更显著,从羽化率指标上看,10±1℃比3±1℃利于冷贮螟黄赤眼蜂。2.3不同冷贮温度和冷贮时间对螟黄赤眼蜂畸形率的影响在3±1℃下,如2.2节,1日龄的螟黄赤眼蜂冷贮4周的畸形率也未统计。三因素方差分析结果表明,冷贮温度(F=195.18;n=71;P<0.01)、冷贮时间(F=300.72;n=71;P<0.001)和冷贮虫龄(F=93.76;n=71;P<0.01)均显著影响螟黄赤眼蜂的畸形率(表5)。三因素间所有可能组合的交互作用也均显著影响螟黄赤眼蜂的畸形率(P<0.05),表明冷贮温度、冷贮时间和冷贮虫龄对螟黄赤眼蜂畸形率的影响作用不相互独立。以米蛾卵繁殖的螟黄赤眼蜂在25±1℃下发育(对照组),畸形率为15.33%。不同冷贮温度下,畸形率均随着虫龄的增大而升高,并随着冷贮时间的延长而显著升高,(表6)。单因素方差分析表明,在10±1℃下,5-9日龄的螟黄赤眼蜂冷贮2,3和4周的所有处理组合,畸形率均显著高于对照(P<0.05);在3±1℃下,6-9日龄的螟黄赤眼蜂冷贮3和4周的所有组合,畸形率均显著高于对照(P<0.05)。以上结果表明,由不同冷贮温度、冷贮虫龄和冷贮时间构成的冷贮环境,部分可显著升高畸形率,偏小虫龄(1-3日龄)或较短时间(1周内)冷贮对畸形率无显著影响。总体来看,不同虫龄螟黄赤眼蜂的畸形率在不同温度下表现相似,均以1-3日龄冷贮影响最小,6-9日龄冷贮影响较大,特别是9日龄冷贮4周时畸形率分别高达81.27%和92.45%,从畸形率指标上看,1-3日龄的赤眼蜂冷贮最佳。3讨论3.1不同冷贮温度对红眼蜂各虫态发育起点温度的影响温度是影响昆虫生长发育的重要生态因子,这是昆虫对环境适应性的一种反映,赤眼蜂也不例外。略低于发育起点温度的低温是赤眼蜂冷贮的良好温度(李丽英等,1983),螟黄赤眼蜂的发育起点温度与寄主、品系、虫态、地理种群等有关。螟黄赤眼蜂各虫态对低温的反应不同(陈科伟等,2002)。米蛾卵内螟黄赤眼蜂的发育起点温度没有记载,结合上述以往报道推测米蛾卵内螟黄赤眼蜂各虫态的发育起点温度在5～12℃范围(李丽英等,1992;鲁新等,2003)。综合比较不同冷贮温度下螟黄赤眼蜂的活蛹率、羽化率和畸形率,结果可知,10±1℃(近于发育起点温度)冷贮的不利影响小于3±1℃,这一结果类似于T.carverae和T.achaeaeNagaraja&Nagarkatti,T.eldanaeViggiani,T.japonicumAshmead最优冷贮温度为10℃相符(JalaliandSingh,1992;Rundleetet2004),近于T.carverae蛹期8℃冷贮优于4℃(Rundleetal.,2004),及玉米螟赤眼蜂TrichogramniaostiniaePangetChen9℃冷贮优于6℃(Pitcheretetal.,2002)的研究结果,而与松毛虫赤眼蜂不符。松毛虫赤眼蜂在10℃可能被诱导滞育,移入适温25℃及其他环境因子下,不能解除滞育而继续发育至羽化,故造成羽化率和单卵出蜂数大幅下降。而螟黄赤眼蜂在米蛾卵内8,10和12℃能均不能诱导成滞育状态(李丽英等,1992;张荆等,1994),因此相对于3℃,10℃更适宜于米蛾卵内螟黄赤眼蜂直接冷贮。3.2赤眼蜂最佳冷贮虫期的筛选以往报道仅以幼虫中后期、预蛹期(2-5日龄)为冷贮虫期进行研究,但大田应用时由于天气等原因常会推迟释放时间,这就需要将准备释放的蛹期赤眼蜂进行冷贮,因此对蛹期(6-9日龄)赤眼蜂的冷贮研究也非常必要,本试验也将此段虫期的螟黄赤眼蜂的列为研究范围。赤眼蜂相关研究大多以卵、幼虫、预蛹、蛹期用于试验,但以目龄划分虫龄具有直观,易操作,并易于指导生产等优点,因此本试验采用此方法划分虫龄。根据以往报道,赤眼蜂最佳冷贮虫龄存在种间差异。10℃冷贮小卵内的暖突赤眼蜂T.achaeae,以蛹期为最佳冷贮虫龄(JalaliandSingh,1992),蛹期的欧洲玉米螟赤眼蜂T.ostiniae和老熟幼虫期、蛹期的短管赤眼蜂T.pretio.sumRiley分别比其他虫期更能长期耐受0℃低温(CurlandBurbutis,1977;LopezandMorrison,1980),卷蛾分索赤眼蜂T.bactrae在3～5℃下冷贮,老熟幼虫期为最佳冷贮虫期(陈科伟等,2004),暗黑赤眼蜂Tpintoi在0～5℃冷贮最佳虫期为预蛹期至蛹前期(马德英等,2004)。赤眼蜂最佳冷贮虫期除与赤眼蜂种类有关之外,与冷贮温度也有关系。柞蚕Antheraeapernyi.卵内的松毛虫赤眼蜂T.dendromili在4℃下的最佳冷贮虫期为幼虫期和蛹期,在7℃下为卵期和蛹期(耿金虎等,2005a)。本研究结果与上述报道相近,最佳冷贮虫龄在不同温度下不同。综合活蛹率、羽化率和畸形率等3个指标,在3±1℃下冷贮的最佳虫龄为25±1℃下发育的4日龄,而在10±1℃下冷贮的最佳虫龄为3日龄。具体而言,从活蛹率指标看,10±1℃下以3日龄及以后的虫龄冷贮为宜,3±1℃下以4日龄及以后的虫龄最佳;从羽化率指标看,10±1℃下3日龄的羽化率在各冷贮时间均最高,3±1℃下2日龄最高,并随着虫龄增大而不断降低;从畸形率指标看,冷贮虫龄越小越好。综合考虑3个因素,10±1℃下冷贮的最佳虫龄为3日龄,3±1℃下冷贮的最佳虫龄是4日龄,这两个对应的虫龄与其他虫龄相比,既能保证最高的活蛹率和羽化率,亦能达到最低的畸形率。3.3各试验对螟黄赤眼蜂红主要影响因素的研究同一温度下各处理组相比,整体而言,随着冷贮时间的延长,螟黄赤眼蜂的活蛹率无显著变化,而羽化率显著下降,畸形率显著上升,5-9日龄的螟黄赤眼蜂的变化最为明显;与对照相比,本研究中2日龄的赤眼蜂在3±1℃,RH95%下冷贮1～3周,羽化率在78.54%～80.62%,与对照(85.59%)相比无显著差异,但冷贮4周的羽化率(62.47%)显著低于对照(85.59%)。1-3日龄的螟黄赤眼蜂10±1℃下冷贮1～4周羽化率与对照均无显著差异。关于米蛾卵内螟黄赤眼蜂羽化率受冷贮时间影响的已有报道结果不一致,吐尔逊等认为幼虫中期在2～5℃下贮藏60d内,羽化率的下降幅度较小,但贮藏期超过60d螟黄赤眼蜂米蛾卵蜂发育后羽化率大幅度下降(吐尔逊等,2005);而潘雪红等报道幼虫中期(约50h)在4±1℃的冰箱中冷贮25d,羽化率低于50%(潘雪红等,2011)。本研究结果与上述报道有一定差异,原因可能在于各试验螟黄赤眼蜂的地理种群不同(耿金虎等,2005a),吐尔逊等(2005)从未注明种群地理来源的玉米放蜂田被寄生玉米螟Ostriniafurnacalis卵块采集赤眼蜂,而潘雪红等(2011)从广西省内甘蔗地采集蜂种。此外可能与本试验在冷贮前后没有设置预冷、暖温环节有关。再者,湿度可能是影响赤眼蜂活蛹率和羽化率另一重要因子(张荆等,1983;潘雪红等,2011;顾俊荣等,2012)。张荆等(1983)认为湿度是玉米螟赤眼蜂T.ostiniae生长发育的重要影响因子。顾俊荣等(2012)报道相对湿度对拟澳洲赤眼蜂T.confusumViggiani的羽化出蜂具有明显的影响,相对湿度在33%时,羽化出蜂率为62.3%;相对湿度在62%以上时,羽化出蜂率均在80%以上。在干燥的冰箱内赤眼蜂羽化率下降迅速(潘雪红等,2011),而本研究为高湿环境,冷贮3周羽化率不显著下降。因此,利用适宜虫龄冷贮米蛾卵内螟黄赤眼蜂时,选择适宜的冷贮