利用人工饲料栽培蛀生性天敌的研究

利用人工饲料栽培蛀生性天敌的研究

在蚜虫相关试验中，以往的试验过程首先培育了蚜虫的寄主植物，然后饲养了蚜虫，最后进行了蚜虫相关试验。而寄主植物的种植需要较大的空间,且在气候不适的条件下,寄主植物生长需要依靠温室,消耗大量人力、物力和财力。同时毒理试验中由于不同的寄主植物上的营养状况不同,如植物自身的病理因素,亦或土壤肥力不均,均可导致蚜虫的生理状况不尽一致,影响试验数据的准确性。而利用人工饲料进行饲养,可获得生理状况一致的蚜虫,节约人力、物力和空间;以人工饲料作为介质,便于开展蚜虫传播病毒机制、营养生理、共生菌、毒理与杀虫活性物质生物测定等研究,对于定量评价转基因植物表达的毒蛋白、农药等毒性物质对天敌昆虫的影响也有一定的借鉴意义。蚜虫人工饲料的研究始于20世纪30年代,Hamilton最先尝试通过将蚜虫置于含有人工饲料的膜下进行饲养,对蚜虫传播病毒机制进行研究。Bradley首次将石蜡膜(parafilm)应用于蚜虫的人工饲料饲养技术中,检测到带病毒的蚜虫个体,并对其口针刺入或穿过惰性基质时病毒的损失情况进行了研究。此后的半个多世纪,众多科研工作者都致力于蚜虫人工饲料配方的改进,分别对氨基酸类、糖类、维生素、无机盐和螯合剂(chelatereagent)等营养成分的种类和剂量进行了研究,开发出了多种蚜虫较理想的饲料配方;继而利用人工饲料作为介质来筛选杀虫剂以及评价毒性物质对天敌昆虫的影响。本文从饲料配方的改进和相关应用两方面进行概述,为今后蚜虫人工饲料配方的改进和应用提供借鉴。1食料中养分的含量与对成虫生长的影响人工饲料必须满足昆虫生长发育的基本营养需求。一般昆虫人工饲料包含:碳水化合物、蛋白质和氨基酸、脂类和固醇类、维生素、无机盐等,有的还需要添加天然营养物。虽然经历了半个多世纪的研究,人工饲料饲养的蚜虫仍摆脱不了个体小、繁殖率低等弊端,导致这些不足的原因众多,其中食料中营养物质含量的差异是最重要的。不同的营养物质在昆虫的生长发育中起着不同的作用,如氨基酸、脂类是构成昆虫虫体的重要物质,维生素、无机盐是众多辅酶的重要组成部分,参与昆虫体内的生理生化代谢活动等。饲料中营养物质的种类和比例是饲料对昆虫适合与否和营养价值发挥的主导因素,确定饲料中的营养成分、含量及各组分的比例显得尤为重要。1.1没有降低桃改后氨基酸的活性氨基酸是构成昆虫虫体的重要物质,是昆虫生长发育的物质基础。Mittler曾报道当总氨基酸浓度低于3%时,桃蚜Myzuspersicae(Sulzer)取食量随着总氨基酸浓度的增加逐渐增加;超过3%时,取食量即开始下降;总氨基酸浓度低于1%时,桃蚜的取食量极低或为零。Dadd和Krieger利用10种必需氨基酸加半胱氨酸饲喂桃蚜,发现3%~4%的氨基酸浓度对桃蚜的生长最适合,浓度继续增加则对桃蚜有害。但有报道桃蚜天然寄主韧皮汁液的总氨基酸浓度一般不会超过1%,桃蚜人工饲料中却需要如此高的氨基酸浓度,可能的原因是:(1)人工饲料上桃蚜的取食率要比在天然寄主上的低,营养物质需要较高的浓度来弥补取食不足的缺陷;(2)人工饲料中氨基酸的相对比例整体上是不平衡的,为了提供充足的个别氨基酸,整体上以较高的浓度可能是必须的,否则可能会使蚜虫的生长受限。有研究表明豌豆蚜Acyrthosiphonpisum(Harris)在人工饲料上的取食率很低,人工饲料上褐飞虱Nilaparvatalugens(Stål)的取食量仅为感虫水稻品种(TN1)上的31%,蚜虫饲养的龟纹瓢虫Propyleajaponica(Thunberg)的取食量约为人工饲料饲养处理的3~4倍,这些研究结果均支持了第一种解释。为明确氨基酸在蚜虫生长发育中的作用,在全纯人工饲料中剔除必需氨基酸观察蚜虫生长发育情况。当饲料中缺乏甲硫氨酸时,桃蚜的取食量减少了50%,甚至在第1代即表现出生长停止;饲料中甲硫氨酸浓度从0mg⋅L-1增加到400mg·L-1,桃蚜的取食量显著增加,继续提高浓度,取食量没有显著的变化,说明甲硫氨酸浓度为400mg·L-1时,已完全满足桃蚜生长发育的需要,继续提高浓度对桃蚜的生长无促进作用,只会增加饲料成本。缺乏半胱氨酸时,第1代也表现生长缓慢,但可以利用无机硫酸盐或添加甲硫氨酸进行补偿,这表明半胱氨酸可能只是硫元素的供给源。缺乏半胱氨酸或组氨酸时,桃蚜的取食量减少了15%~33%;缺乏其他氨基酸的处理,对取食量影响较小或几乎没有影响。Mittler将若蚜饲养在逐一剔除10种必需氨基酸的饲料上,若虫体重均明显下降;当缺乏组氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸时,若虫体重表现出最明显的下降;当饲料中缺乏非必需氨基酸中的一种时,均未对若蚜的体重产生影响,而缺乏天门冬氨酸、谷氨酸、天门冬酰胺和谷氨酰胺这一组混合氨基酸时,极大地限制了桃蚜的生长,即使逐一剔除也有同样的效果。不同的氨基酸在蚜虫生长发育过程中发挥着不同的作用,缺乏不同氨基酸生长不良表现的时间也不尽一致,但显而易见的是,缺乏必需氨基酸时,蚜虫的不适在短时间内即开始显现。1.2蔗糖的配合作用糖类是生物体内能量的主要来源,对蚜虫具有刺激取食和提供营养双重作用,同时又是营养液渗透压的调节剂。在糖类中,蔗糖的刺激取食作用最显著、作用范围最广泛,其次是果糖和葡萄糖。不同蚜虫种类对糖类的需求差异较大,除了自身营养需求的差异,有的种类可能只是依靠蔗糖的促食作用。桃蚜的人工饲料中蔗糖的最佳取食浓度为10%~20%,高于20%时,桃蚜的取食量逐渐下降。棉蚜Aphisgossypii(Glover)的饲料中蔗糖最佳浓度为25%~30%,并有试验证实在饲料中加入20%蔗糖和10%麦芽糖,比单用蔗糖饲养效果要好,尤其是对后代的生长更为有利,可能是来自饲料中的不同营养物的互补作用更有利于蚜虫的生长发育。豌豆蚜所需糖浓度为35%,麦长管蚜Macrosiphum(Sitobion)avenae(Fabricius)所需糖浓度为20%~30%,桔二叉蚜Toxopteraaurantii(BoyerdeFonscolombe)所需蔗糖浓度比其它蚜虫要高,为55%。1.3全纯人工饲料添加量的确定维生素对昆虫生长发育具有重要作用,很多维生素是生物体内辅酶的重要组成部分,和酶一起参与昆虫的生理、生化代谢,是昆虫生长发育不可或缺的营养成分。几乎所有昆虫都需要从食物中获得胆碱。肌醇是一种重要的磷脂化合物,有促进生长发育的作用,对大多数植食性昆虫是极其重要的。在全纯人工饲料中逐一剔除个别维生素,确定人工饲料中必需的9种水溶性维生素:硫胺素、核黄素、烟酸、吡哆醇、叶酸、泛酸钙、肌醇、胆碱和生物素。当饲料中缺乏硫胺素、烟酸和泛酸钙时,第1代若蚜的平均体重显著降低,若虫的发育历期延长;缺乏其他维生素时,第1代若蚜的平均体重也显著降低,但并未延长若虫发育历期;而试验进行至第2代时,缺乏任何1种维生素平均体重增长极其缓慢。Dadd认为饲料中核黄素浓度为5mg·L-1时对桃蚜最合适;而Akey和Beck发现,为了提高饲料对豌豆蚜的适合性,获得最优饲养效果,需要高浓度的核黄素(50mg·L-1),其原因可能是铁、铜、锰等微量元素消耗了部分核黄素;Markkula和Laurema也提出由于核黄素能够结合矿质元素,会导致蚜虫摄取微量元素的减少;在核黄素存在的情况下,可能需要适当提高微量元素的含量。而Ehrhardt发现核黄素浓度为50mg·L-1时对百合沟新瘤蚜Neomyzuscircumflexus(Buckton)的生长和繁殖都有负面影响;Mittler通过试验证实核黄素对桃蚜是有害的,而且核黄素在氯化矿物作为金属离子螯合剂时的危害比乙二胺四乙酸(EDTA)处理要明显。由于不同蚜虫的生理、生化代谢的不同,导致其对核黄素的需求也表现出较大的差异,但由于核黄素对百合沟新瘤蚜和桃蚜的生长有负面作用,在其饲料中不宜添加。无机盐也是蚜虫人工饲料中不可缺少的营养成分之一。其中以磷、钾、镁、钙和钠5种元素最为重要,如饲料中不含这些无机盐,蚜虫3~4d就会死亡。Dadd在研究微量元素对桃蚜生长发育的影响时发现,缺失铁或锌时,第1代若虫开始显现生长不良,缺失锰则在第2代开始显现,而对于铜的需求则在第3代得到表现。当添加铁、锰、铜和锌4种微量元素时,人工饲料明显能够长期满足桃蚜生长发育的需求。添加天然的营养物或利用天然营养物来替代全纯人工饲料中的确定成分,可以弥补全纯饲料中纯化学物质的缺陷,为蚜虫提供更加全面的营养,增加饲料对昆虫的适合性。酵母所含的营养物质较为丰富,其中蛋白质和核酸的含量约为50%,糖类37%~40%,脂类为2%~3%,水溶性维生素可达0.5%,而且含有B族维生素、氯化胆碱、生物素、微量元素、叶酸和肌醇等营养物质,是较理想的营养替代物,在昆虫的人工饲料中添加较为常见。Dadd发现在全纯人工饲料中加入4~6g·L-1的天然酵母或核苷酸,能显著促进桃蚜的生长发育,获得发育整齐、生长一致的桃蚜;而Markkula和Laurema则发现添加20g·L-1酵母处理对蚜虫的生长发育促进效果最佳,成蚜平均体重达到600~800μg,而全纯人工饲料上饲养的桃蚜平均体重仅为500μg,提高了20%~60%。Dadd通过将煮熟和过滤的芥菜或莴苣汁液添加至饲料中,芥菜和莴苣压榨的汁液在总饲料中的浓度分别达到2%和10%时,均获得了最优效果;浓度继续提高时,对桃蚜的生长发育将产生不利影响。1.4edta的饲养效果为了增加昆虫对矿质元素的吸收和利用,尤其是微量元素,常需要添加螯合剂来螯合微量元素,避免微量元素营养成分的丧失,常用的螯合剂有EDTA、氯化离子、柠檬酸和抗坏血酸。Dadd通过试验确定了桃蚜饲料中EDTA含量的最优水平。而对其它种类的蚜虫、飞虱和叶蝉的调查研究表明,等量的微量元素以氯化物螯合获得了与EDTA处理同样的饲养效果,有的处理甚至为最优。也有研究表明EDTA对蚜虫的生长具有负面效应,可导致桃蚜定居和产仔较差、影响有翅和无翅蚜的比例、导致饲养在包含EDTA饲料上的蚜虫代数减少等。EDTA对微量元素的吸附力较强,螯合物较难分离,增加了昆虫吸收矿质元素的难度。此外,EDTA复合物被吸收后,是与昆虫的中肠细胞发生相互作用,还是同大分子有机配体保持在细胞外,尚未得出定论。抗坏血酸不仅可以延缓营养物质被氧化,还可作为螯合剂与矿质元素形成复合物。抗坏血酸和柠檬酸的分子量显著小于EDTA,矿质元素与这些天然的配基形成的复合物比EDTA复合物更容易进入肠道细胞,这种复合物形式不仅有利于保持饲料中矿质元素的稳定,而且有利于蚜虫对矿质元素的消化吸收和利用。Mittler连续调查2代桃蚜的生长状况,在无抗坏血酸的饲料上第1代3日龄的桃蚜若虫的体重与有抗坏血酸的处理相似,但是第2代无抗坏血酸处理,即使添加柠檬酸,桃蚜的生长状况也是极差的,说明抗坏血酸不仅仅是简单的螯合作用,而可能与蚜虫的某种生理功能相关。2药物的筛选目前蚜虫全纯人工饲料的应用主要体现在利用人工饲料作为介质来进行蚜虫的生理测定或评价,并以此为基础研究其营养生理和筛选杀虫剂;继而以人工饲料饲养的蚜虫作为食料,评价对天敌昆虫的适合性,乃至在蚜虫人工饲料中添加毒性物质,评价对天敌昆虫的潜在影响等方面。2.1不同植物生长特性的饲料对桃改后食性的影响由于蚜虫特殊的取食方式,对其所致危害的检测难度很大,目前尚未有便捷的检测方法,而利用人工饲料作为介质,在人工饲料中添加显色物质,颜色的深浅与取食量成正比,通过颜色的深浅与取食量建立关系方程,从而计算取食量,可以很好地解决这一难题;同时蚜虫分泌的蜜露中化学物质的含量与其取食对象之间存在着一定的相关性,通过分析人工饲料饲养的蚜虫分泌的蜜露,建立与蚜虫饲料成分的关系,利用此原理可对寄主体内某些特定物质的浓度进行定量分析;通常寄主体内存在着对蚜虫有抗性作用的拮抗物质,通过在人工饲料中添加这些物质,判断其对蚜虫生长发育的利弊,可为提炼杀虫活性物质提供借鉴。Parry和Ford在人工饲料中添加0.1%中性红,利用颜色的深浅来分析蚜虫的取食量,对桃蚜的危害进行定量分析。Merritt利用蚜虫蜜露与取食物质之间的关系,检测到黑芥子硫苷酸的浓度在幼叶韧皮部中很高(>10mmol·L-1),这与先前韧皮部中化感物质的浓度仅以低浓度存在的观点相矛盾。由于桃蚜地理种群的不同,甚至寄主植物的不同,对同一饲料的取食能力表现也不尽相同,而且不同亚种对磷铵和中性红的敏感性也有所不同。在人工饲料里面逐一添加24种植物次生物质,除了黑芥子硫苷酸钾和番茄素,其他处理均使得饲料对桃蚜的适合性降低。马铃薯含有丰富的甾体类物质,如:α-茄碱和α-卡茄碱。在桃蚜人工饲料中添加甾体茄碱(Gas)——α-茄碱和α-卡茄碱,成蚜对高浓度处理表现敏感,与空白对照相比,繁殖率下降,取食率降低,死亡率增加。取食饲料的若蚜发育历期延长,内禀增长率降低。而低浓度处理则改善了蚜虫的繁殖性能和对饲料的适应性。而Sanford等则认为茄碱是植物抗虫特性中防御机制的组成成分,能够抑制蚜虫的生长繁殖。甾体茄碱类物质对桃蚜来说是刺激取食因子还是抑制因子,尚未得出定论,有待进一步深入研究。2.2根据人工饲料，评价毒性物质对蚜虫和天敌的影响2.2.1桃嗪类药物对桃改后生长和分布的影响在评价和筛选杀虫活性物质对蚜虫的影响时,利用人工饲料作为介质,可以方便快捷地定量添加毒蛋白、抗生素、抗菌肽等杀虫活性物质,为相关试验提供了便利。Down等通过在人工饲料中添加0.1%雪花莲凝集素(GNA),发现茄粗额蚜Aulacorthumsolani(Kaltenbach)的繁殖力降低了65%,存活率降低了10%,而且若蚜的体长和体宽的增长率降低了40%,对茄粗额蚜表现出明显的杀虫活性;Couty等也通过试验证实,茄粗额蚜取食含GNA的饲料后,蚜虫生长量降低,死亡率大大升高。GNA对桃蚜的负面作用,表现在生长量显著下降,体长和体宽都显著小于对照。在饲料中添加多杀菌素对甘蓝蚜的繁殖力和生殖力均无负面作用。而添加不同的抗生素,0.001%、0.01%的金霉素和0.01%的氯霉素显著影响桃蚜的繁殖力,即使0.0001%的金霉素也可减少桃蚜的生长量,显著缩短有翅蚜产生的时间。而扁桃酰胺、青霉素-G、硫酸链霉素、硫酸异样霉素对若虫的生长影响不大,甚至在浓度高达0.1%时影响也不明显。Le-Feuvre等通过组织学分析发现,添加抗菌肽indolicidin处理的桃蚜体内出现少量变形的含菌细胞,而对照则含有丰富的圆形饱满的含菌细胞;添加抗菌肽处理桃蚜死亡率显著增加,且致死效果与剂量显著相关,说明蚜虫体内内共生菌与蚜虫的生理功能直接相关,共生菌的病变或减少直接影响蚜虫的存活和生长。在人工饲料中添加吡咯里西啶类生物碱,对不同属昆虫的影响也各有不同。千里光碱和千里光菲灵碱在与寄主植物相当的浓度时即降低了桃蚜的存活率;野百合碱仅在最高浓度时(为正常植物2倍)才导致桃蚜的死亡率增加;而肾形千里光碱基本对桃蚜的存活率没有影响。在可控的光周期和温度条件下,利用人工饲料作为基质,添加不同浓度的环-(脯氨酸-酪氨酸)、环-(组氨酸-脯氨酸)、阿洛氨菌素和psammaplinA4种几丁质酶抑制剂,除了环-(脯氨酸-酪氨酸)未改变蚜虫的族群参数外,其他几丁质酶抑制剂均产生了不同的杀蚜虫效果;环-(组氨酸-脯氨酸)的所有剂量对蚜虫的日繁殖量、内禀增长率和种群倍增时间均有显著影响。饲料中添加阿洛氨菌素降低了若蚜的存活率和日繁殖量,种群倍增时间从1d增加到1.5d;PsammaplinA在50μg·mL-1和100μg·mL-1时,几乎杀灭了所有蚜虫。蚜虫内共生菌抗性物质和几丁质酶抑制剂在蚜虫存活和繁殖中起着至关重要的作用,为控制蚜虫为害提供了新的思路,在今后杀虫剂的开发中要给予重视。2.2.2人工饲料饲养的桃改蜂对不同性别的影响由于人工饲料饲养的蚜虫体内营养物质可能与寄主植物上的有较大差异,以其作为食料必然会对天敌昆虫产生影响,通过比较两组天敌昆虫生长发育的差异,明确利用此方法进行天敌昆虫扩繁的可行性。vanEmden和Andrews基于小麦互益素在蚜茧蜂对寄主选择性中的重要性,预测利用人工饲料饲养的桃蚜繁育寄生蜂是不可行的。而vanEmden和Kifle利用人工饲料饲养的蚜虫繁育粗脊蚜茧蜂AphidiuscolemaniViereck,人工饲料饲养的蚜虫繁育的寄生蜂虽发育历期延长了16%,雌蜂后足胫节的长度减小了2%,但能够顺利完成生长发育,产卵量也与对照无显著差异,说明利用人工饲料饲养的桃蚜来饲养寄生蜂是可行的。无论是利用天然寄主或者人工饲料饲养的蚜虫繁育寄生蜂,雌蜂的产卵量随着蚜虫龄期的增加而增加;而对性别进行比较时,发现同等大小的蚜虫,人工饲料饲养的蚜虫产生的寄生蜂有更高的偏雌性,可能是雌蜂在产卵时的选择性或不同性别抗逆性的差异所致。饲养在人工饲料上的桃蚜被粗脊蚜茧蜂寄生,羽化的寄生蜂后代对饲料、球茎甘蓝、甘蓝和大白菜的气味无明显的趋向性,但对于母本经历的气味有一定的趋向性。作者采用人工饲料饲养的桃蚜饲喂日本通草蛉Chrysoperlanipponensis(Okamoto)[异名:中华通草蛉Chrysoperlasinica(Tjeder)],发现对草蛉的生长发育、繁殖以及营养物质含量和消化酶活性均有不同程度的影响,虽部分龄期发育历期有所延长、蛹重较轻、单雌产卵量有所降低,但整体上其作为扩繁日本通草蛉的食料是可行的。由于昆虫不同发育阶段所需要的关键营养不同,利用人工饲料饲养的蚜虫繁殖天敌昆虫所产生的差异,作者认为是人工饲料饲养的桃蚜与天然寄主饲养的桃蚜营养物质含量的差异,本人的试验结果证实这一猜测(待发表数据)。2.2.3不同浓度gna对桃双向生殖发育的影响在分析转基因作物表达的毒蛋白对天敌昆虫的影响时,利用传统的方法:种植转基因作物-蚜虫-天敌昆虫,既耗时、耗功,毒蛋白含量测定也比较繁琐;而利用人工饲料作为介质,可简单便捷地定量添加毒蛋白,为评价这些毒性物质对天敌昆虫的影响提供了便利。Couty等利用包含GNA的饲料饲养茄粗额蚜,继而饲养苜蓿蚜小蜂Aphelinusabdominalis(Dalman),发现GNA对蚜小蜂并无直接的负面作用,但由于GNA处理的寄主个体大小与对照存在差异,对蚜小蜂的性比和个体大小有间接的影响;同时通过免疫蛋白印迹技术分析,蚜小蜂可以排泄出大部分摄入的GNA。GNA可以通过营养转移对寄生蜂的生长发育产生负面影响,而且与浓度直接相关。虽然0.02%和0.045%GNA处理的僵蚜重量和性比与对照差异不显著,但随着GNA浓度的提高,僵蚜形成率、成蜂羽化率和成蜂获得率逐渐下降;0.02%GNA处理的成蜂体重显著低于对照,0.1%GNA处理发育至僵蚜的时间显著长于对照,并且无寄生蜂发育至成虫。在桃蚜人工饲料中添加不同浓度的GNA,Down等发现对二星瓢虫Adaliabipunctata(L.)成虫寿命无不利影响,却有改善其繁殖力的趋势,产卵量增加到对照的70%,卵孵化率也明显提高,说明GNA对二星瓢虫无害,甚至有改善其生长和繁殖的作用。Down等也证实取食GNA处理的蚜虫对二星瓢虫幼虫未表现出明显的毒性,反而取食蚜虫的数量显著高于对照,但幼虫虫体比对照小8%~15%,4龄幼虫的发育历期延长,发育至蛹总体上延长了4d。而添加黑芥子硫苷酸钾则不同,当饲料中黑芥子硫苷酸钾的浓度达到0.2%时,二星瓢虫1龄幼虫即不能存活;相反,饲料中黑芥子硫苷酸钾的浓度高达1%时,七星瓢虫CoccinellaseptempunctataL.1龄幼虫仍能够存活,但延长了其发育历期。这些结果表明,黑芥子硫苷酸钾对二星瓢虫有强烈的抑制甚至毒杀作用,但对于七星瓢虫的抑制作用是有限的,而GNA对二星瓢虫生长发育的影响十分有限。而GNA可显著延长普通草蛉Chry