天芪降糖胶囊降糖调脂的机制1

#应用基因芯片探讨天芪降糖胶囊降糖调脂的机制张茜肖新华王彤李文慧袁涛孙晓方孙琦向红丁王姮【摘要】目的探讨天芪降糖胶囊改善血糖和血脂的机制。方法选用KKAy小鼠16只，随机分为天芪组（给予1.5g/kg・d的天芪降糖胶囊粉末悬浊液）和对照组（给予等体积生理盐水），灌胃4周。测定小鼠FBG、血脂和FINS,并行OGTT实验。取小鼠骨骼肌进行RT-PCR基因芯片实验。结果天芪组FBG、OGTT曲线下面积（AUC）、HOMA-IR、TC和TG均比对照组显著降低（P〈0.05或P〈0.01）。基因芯片显示天芪组GLUT4、MAPK8、MAPK14和PPARa上调，PPARy、PGC、CEBP、TNFa、NFkB、ICAM-1和IL-6下调。结论天芪降糖胶囊能有效降低KKAy小鼠FBG，调节脂代谢。其血糖降低机制可能与MAPK通路和GLUT4上调有关；另外可能通过下调炎症因子水平改善胰岛素抵抗。血脂改善可能与PPARa上调有关。【关键词】天芪降糖胶囊；KKAy小鼠；基因芯片；糖尿病；脂代谢紊乱ThemechanismofTianqicapsuleonglucoseandlipidregulatingusingRTPCRarrayZHANGQian,XIAOXin-Hua,WANGTong,etal.DepartmentofEndocrinology,PekingUnionMedicalCollegeHospital,PekingUnionMedicalCollege,Beijing100730,China【Abstract】ObjectiveToexploretheeffectsofTianqicapsuleontheFBG,lipidmetabolismandFINSinKKAymiceandtoinvestigatetheirpossibletherapeuticmechanisms.MethodsKKAymicewererandomlydividedintotwogroups:Tianqigroup（treatedwith1.5g/kg・dTianqi）andcontrolgroup（treatedwiththesamevolumeofNS）.Treatmentlastedfor4weeks.FBG,TC,TG,HDL-c,LDL-candFINSweredetected.TheOGTTtestwasdone.RTPCRarrayexperimentwasdonewithskeletalmuscle.ResultsTianqicapsulecoulddecreaseFBG,glucoseareaunderthecurve（AUC）,HOMA-IR,TCandTG,comparedwiththoseofcontrolgroup（P<0.05orP<0.01）.RTPCRarrayindicatedthatTianqiup-regulatedtheexpressionofGLUT4、MAPK8、MAPK14andPPARa,whiletheexpressionofPPARy、PGC、CEBP、TNFa、NFkB、ICAM-1andIL-6weredown-regulated.ConclusionsTianqicapsulepossessesthefunctionsofregulatingthelevelsofbloodglucoseandlipidsinKKAymice.Andtheglucose-lowingmechanismsarecorrelatedwithGLUT4andMAPKpathway,andPPARaup-regulatedinvolveswithlipid-regulating.Moreover,Tianqicapsulecandecreaseinflammatorycytokinestoimproveinsulinresistance.【Keywords】Tianqicapsule;KKAymice;RTPCRarray;diabetesmellitus;lipidsdisorder天芪降糖胶囊是由黄芪、天花粉、人参、石斛、女贞子、黄连、地骨皮、山茱萸、旱莲草、五倍子等十多味中药组成的中药复方制剂,临床研究表明其具有益气养阴、清热生津、补肾涩精等作用,已在国内广泛应用于改善血糖、血脂的治疗,但其降糖调脂的确切机制不详。本研究旨在探讨天芪降糖胶囊对糖尿病小鼠FBG、血脂和FINS的影响,并用基因芯片技术探讨其改善血糖、血脂的机制。材料与方法一、动物分组及处理雄性KKAy小鼠，体重30.021.83g，购自中国医学科学院动物所，喂以特殊的高脂饲料（每克饲料含58%脂肪，25.6%碳水化合物，16.4%蛋白质，由中国医学科学院动物所提供）。小鼠适应72小时后，测随机血糖均高于11.1mmo1/L。将KKAy小鼠随机分为天芪治疗组（给予1.5g/kg・d天芪粉末悬浊液）和生理盐水对照组（给予等体积生理盐水），每组8只。每天灌胃一次,每次每只灌胃0.3mL,持续4周。天芪粉末悬浊液是用天芪降糖胶囊（黑龙江宝泉制药有限公司）药粉溶于生理盐水中配成150g/L悬浊液。二、相关指标测定于开始灌胃当天，喂药后7、14、21、28天测量KKAy小鼠体重、FBG（禁食4小时尾部取血，葡萄糖氧化酶法）。灌胃后第21天行OGTT实验，即KKAy小鼠禁食4小时后，灌胃葡萄糖溶液（2.2g/kg体重），测定0、30、60、120min各时间点的血糖值，计算AUC，AUC=0.5x（0分钟血糖+30分钟血糖）/2+0.5x（30分钟血糖+60分钟血糖）/2+1x（60分钟血糖+120分钟血糖）/2。灌胃后第28天，禁食4小时，处死，摘眼球取血，ELISA法测定FINS（LincoCorp），计算HOMA-IR,H0MA-IR二FBG（mmol/L）xFINS（卩U/mL）/22.5。酶法测定TC、TG、HDL-c和LDL-c。三、RT-PCR小鼠糖尿病基因芯片实验肌肉组织总RNA抽提：处死小鼠后，立即取肌肉组织置液氮冻存备用。天芪组和对照组各取3个样本。TRIZOL法提取RNA。紫外吸收测定法和变性琼脂糖凝胶电泳对RNA含量和质量进行鉴定。合成cDNA:总RNA逆转录得到单链cDNA。实时定量PCR芯片：本研究应用小鼠糖尿病PCR芯片（PAMM-023，SuperArrayBioscienceCorp,Frederick,MD，其包括90个糖尿病相关基因，涉及受体、转运、通路、核受体、代谢酶、分泌因子、信号转导以及转录因子等。将cDNA稀释后加入PCR芯片对应的每个孔中，将PCR芯片置于实时定量PCR仪进行PCR反应，设置程序如下：10分钟95°C，15秒钟95°C，1分钟60°C（40个循环），收集荧光信号。计算天芪组和对照组中的每个通路相关基因的△Ct值，相减得到每个基因的△△Ct值。通过2-AACt计算两组对应基因的表达差异。管家基因为hsp90ab1。fold-change值的绝对值＞2，而且P值＜0.05的基因为具有显著差异。四、统计学处理定量指标均以xs表示。对定量资料，符合正态分布的数据采用Student'st检验；不符合正态分布的数据经对数转换后采用Student'st检验。采用SPSS15.0进行数据分析。基因芯片的数据用△C法计算，用PCRArray数据分t析软件（Excel&Webbased）进行分析。结果一、天罠对KKAy小鼠体重、FBG、AUC、FINS、HOMA-IR和血脂的影响在给予天芪前（0周）对照组和天芪组体重、FBG无显著差异。给予天芪1至4周，天罠组较对照组体重无显著差异，FBG持续显著下降（P<0.01）（表1）。OGTT结果显示天罠组在葡萄糖灌胃前（Omin）以及灌胃后30、60、120min各时点血糖值及AUC均显著低于对照组（0min和30minP<0.01,60min、120min和AUCP<0.05）（表2）。给药4周后天罠组FINS,HDL-c和LDL-c较对照组无显著差异，但HOMA-IR,TC和TG明显降低（P<0.05）（表3）,提示天罠具有改善KKAy小鼠胰岛素抵抗和脂质代谢紊乱的作用。表1天罠干预前后KKAy小鼠体重和FBG比较（X+s）Tab1EffectofTianqionthemeanbodyweightandFBGofKKAymice(x土s)组别Group例数n0周0week1周1weeks2周2weeks3周3weeks4周4weeks对照组Control体重Weight(g)830.57±2.4031.99±3.2932.24±3.1432.93±1.3033.04±1.48FBG(mmol/L)816.15±8.9919.65±2.1418.20±5.0624.78±8.8020.57±5.81天芪组Tianqi体重Weight(g)830.65±1.6831.11±3.6831.70±2.2032.00±1.8532.14±0.86FBG(mmol/L)816.38±6.4110.43±5.47**10.35±3.29**9.98±3.71**9.33±1.78**与对照组比vscontrol**P<0.01表2天罠干预3周后OGTT血糖和血糖曲线下面积（AUC）结果比较（x土s,mmol/L）Tab2EffectofTianqionoralglucosetoleranceinKKAymice(x土s,mmol/L)组别例数0'血糖30'血糖60'血糖120'血糖血糖曲线下面积GroupnBG0minBG30minBG60minBG120minAUC对照组824.78±8.8029.98±4.9222.12±10.6617.72±8.2345.40±10.80Control天芪组89.98±3.71**20.50±6.87**14.05±8.28*9.47±4.74*27.65±12.00*rp••Tianqi与对照组比vscontrol*P<0.05**P<0.01

表3天芪干预4周后FINS、HOMA-IR和血脂比较（X土s）Tab3.EffectofTianqionFINS,HOMA-IRandlipidmetabolicparametersinKKAymice(X+s)组别Group例数nFINS(UU/mL)HOMA-IRTC(mmol/L)TG(mmol/L)HDL-c(mmol/L)LDL-c(mmol/L)对照组817.16丄7.705.80±2.835.2±1.931.29±0.403.66±0.950.86±0.20Control天芪组814.08丄8.365.10丄2.90*3.09丄0.56*0.79±0.16*3.99±1.760.92±0.41rp••Tianqi与对照组比vscontrol*P<0.05二、基因芯片结果有关胰岛素通路的基因，天芪组与对照组无显著差异，包括AKT2，IKK2,IRS1,PIK3CD,PIK3R1和PTP1B。在糖代谢方面，天芪组GLUT4(fold-change=3.33)和MAPK通路［包括MAPK8(fold-change=9.47)和MAPK14(fold-change=4.19)］基因上调。脂肪通路基因中天芪组PPARy(fold-change=-3.08)、CEBP(fold-change=-3.53)和PGC(fold-change=-2.33)下调，PPARa(fold-change=3.23)上调。炎症因子方面：天芪组TNFa(fold-change=-3.16)、NFkB(fold-change=-3.99)、ICAM-1(fold-change=-2.91)和IL-6(fold-change=-2.51)下调(图1)。1.E-32-CEBP\—KAPKSPPARY\KFkILSSPGC\1.E-32-CEBP\—KAPKSPPARY\KFkILSSPGC\1ICA3£1\ZPPARaZGLUT4■*♦**爼片火山图lcanoPlotgraphJt-检验的p］值。横坐标代表每个基因的fold^change=1。粉线代表foFig1图中纵坐标代表基因芯片上每」「fold-change取Log2的结果。黑线代表司》=丄2。右侧粉线右面为fold-change＞2,左侧粉线左面为fold-chang』＜-2。蓝线代表P值=0.05。蓝线上面为P值＜0.05。此图中标注名称的基因为天芪组较对照组有显著差异的11个基因。ld-changeThisgraphshowsthatthelog2ofthefoldchangeineachgene'sexpressionbetweenthesamplesisversusitsPvaluefromthet-test.Theblacklineindicatesfoldchangesof1.Thepinklinesindicatethefold-changeingeneexpressionthresholdis2,ThebluelineindicatesthePvalueofthet-test(thresholdis0.05).Thereare11geneswhichshowsignificantlydifferentexpressionbetweenTianqigroupandcontrolgroup.讨论本研究实验对象KKAy小鼠为自发性糖尿病动物模型，在高脂饲料喂养下出现肥胖、脂代谢紊乱和高血糖等代谢异常，是目前研究人类2型糖尿病较为理想的动物模型。基因芯片技术作为一种先进的高通量检测技术，具有灵敏、准确、快速、高信息量等优点，可以对个体生物的大量基因表达信息进行高速、并行采集和分析。骨骼肌在能量平衡方面处于首要地位，是胰岛素刺激的葡萄糖摄取和利用的重要组织。我们选取KKAy小鼠的骨骼肌作为基因芯片实验材料，所用RT-PCR小鼠糖尿病基因芯片是一种功能分类基因芯片，包含有与糖尿病相关的多个生物学代谢通路的基因。研究发现天芪降糖胶囊能显著降低KKAy小鼠FBG、AUC,改善胰岛素敏感性。还发现其能显著降低KKAy小鼠的血清TC和TG水平，与以往的临床和实验研究结果一致［1-3］。胰岛素信号通路是在胰岛素刺激下，肌肉和脂肪组织摄取利用葡萄糖的重要途经。本研究发现在有关胰岛素通路的基因表达中，天芪组与对照组无显著差异。揭示调节胰岛素信号通路可能并不是天芪降糖胶囊降血糖的机制。AMPK(AMP激活的蛋白激酶)是非胰岛素依赖性的调节葡萄糖转运的因子［4］。Xi等发现AMPK能使p38MAPK上调⑸。在肌肉细胞，p38MAPK参与GLUT4的激活⑹门。本研究发现天芪组MAPK通路和GLUT4基因是上调的。推测天芪降糖胶囊可能是通过AMPK-p38MAPK-GLUT4通路来改善葡萄糖摄取利用的。有研究表明许多核转录因子如PPAR家族、CCTTA/增强子结合蛋白家族等在脂肪分化中起重要作用［8］，它们共同诱导一系列脂肪细胞特异表达的基因，从而使细胞得以最终分化。2型糖尿病大鼠肝脏PGC-1表达升高。PGC-1能刺激葡萄糖异生和脂肪酸氧化⑼。天芪降糖胶囊能下调PPARy、PGC和CEBP水平，这可能是天芪组在治疗四周后体重略低于对照组的机制之一。PPARa与血脂代谢关系密切，在多个水平参与血脂的调节a,如促进脂肪酸氧化和胆固醇逆向转运，降低血TG和TC。本研究显示天芪组PPARa基因水平是上调的,这可能是天芪降糖胶囊调节血脂的重要机制之一。另外，有研究表明许多炎症因子通过血液或/和旁分泌的作用干扰胰岛素的信号传导而导致胰岛素抵抗。本研究发现天芪组炎症因子TNFa、NFkB、ICAM-1和IL-6基因均是下调的。揭示天芪降糖胶囊能抑制炎症因子表达，胰岛素抵抗的改善可能与之有关。总之，本研究观察到天芪降糖胶囊能有效降低KKAy小鼠血糖，改善胰岛素敏感性和血脂水平。应用功能分类基因芯片技术分析天芪降糖胶囊对KKAy小鼠骨骼肌基因表达谱的影响，为探讨天芪降糖胶囊的降糖调脂机制提供了体内实验依据。当然，天芪降糖胶囊确切的降糖调脂机制还有待进一步深入研究和挖掘。参考文献周轻伟,宗瑞义,谢湘林,等.天芪胶囊降糖作用的实验研究.中草药,1997,28(2):95-97.赵泉霖,郭宝荣,杨文军.天芪降糖胶囊治疗2型糖尿病300例.山东中医药大学学报,2003,27(3):191-192.蔡寒青,葛焕琦,张秀娟,等.天芪降糖胶囊治疗2型糖尿病60例临床观察.吉林大学学报(医学版),2003,29(5):669-671.MuJ,BrozinickJTJr,ValladaresO,etal.AroleforAMP-activatedproteinkinaseincontraction-andhypoxia-regulatedglucosetransportinskeletalmuscle.MolCell,2001,7(5):1085-1094.XiX,HanJ,ZhangJZ.StimulationofglucosetransportbyAMP-activatedproteinkinaseviaactivationofp38mitogen-activatedproteinkinase.JBiolChem,2001,276:41029-41034.SomwarR,KimDY,SweeneyG,etal.GLUT4trans