非标记酸灌注法产生丙酸的速率及液相吸收的研究

非标记酸灌注法产生丙酸的速率及液相吸收的研究

首先，研究表明，山羊丙酸对肿瘤胃的吸收率为64%-79%。但是,这些研究条件一般不能保持正常的瘤胃发酵条件,其结果的适应性具有局限性。随着我国对饲喂优质、高产肉羊的重视,研究在高产性能下因瘤胃丙酸产生量增加引起吸收规律的变化应予重视。而至目前为止,除Peters等报道了利用同位素标记挥发性脂肪酸(VFA,下同)法直接测定饲料碳水化合物在反刍动物瘤胃原位置的产生速率外,有关采用直接测定VFA产生速率的方法及研究报道甚少。本试验先研究在模拟连续饲喂条件下瘤胃丙酸的基本产生速率(饲料碳水化合物发酵产生的),然后通过连续灌注法,改变瘤胃丙酸产生速率,研究丙酸的瘤胃上皮吸收和向后消化道的流通规律,为探讨瘤胃丙酸发酵的最优控制提供科学依据。1材料和方法1.1试验动物采用4只带有瘤胃瘘管和十二指肠瘘管的1.5岁左右的绵羊(来自内蒙古红格塔拉种畜场),体重为28.8±2.1kg。1.2羊草粉饲料的制备精料补充料组成:玉米70%,小麦麸7%,芝麻饼15%,国产鱼粉5%,骨粉2%,微量元素预混料0.68%,复合多维0.02%,以及食盐0.25%。粗饲料为羊草,日粮粗精比为54∶46,粗料长不超过5mm,以保证其在瘤胃发酵均匀。粗、精料分开饲喂,每3h饲喂1次,且先投粗料,后喂精料,尽可能模拟连续饲喂。1.3精、粗饲料喂量按中国美利奴羊饲养标准(1985)计算每天的精、粗饲料喂量,绵羊的能量维持需要为450kJ/kgW0.75,蛋白质维持需要为350mgN/kgW0.75,饲养水平为1倍维持需要。1.4试验溶液的使用试验羊在预饲期间和试验期间均放进代谢笼中饲喂,晚上给予连续光照便于采食,并保证自由饮水,但试验期间停止供水而用灌注的试验溶液满足水的需要。预饲期至少1周。1.5丙酸钠基本产生率的计算1.5.1新的稳态下瘤胃丙酸基本产生速率的确定计算瘤胃内VFA产生速率的前提是瘤胃VFA的产生速率与它们从瘤胃的消失率保持平衡即所谓稳态,然后通过启动灌注和连续灌注VFA的方法,打破瘤胃的稳态使其浓度变化,经过一段时间又达到新的稳衡状态。通过瘤胃某VFA浓度的变化计算VFA的基本产生速率(mmol/h)。假定丙酸的基本产生速率为P(mmol/h),用U(mmol/h)代表丙酸的消失速率,C(mmol/L)代表基本稳态下瘤胃中丙酸的浓度。当瘤胃VFA产生处在稳态下,可假定瘤胃丙酸的消失与丙酸的库容量(Poolsize)成正比,可得出如下平衡方程:P=U=kCV(1)式中:k(/h)为比例常数;V(ml)为瘤胃液相体积。通过向处在基本稳态的瘤胃连续灌注一定浓度的丙酸溶液打破其稳态,并假定灌注丙酸的连续恒定速率为I(mmol/h),如果VFA的灌注不改变瘤胃基本发酵模式,则新的稳态方程为:P+I=U′=kC′V′(2)式中,U′、C′、V′分别表示新的稳态下丙酸的消失速率、丙酸的浓度和瘤胃液相体积。将方程(2)减去方程(1)得到比例常数k:k=I/(C′V′-CV)(3)用k值取代(1),则得到稳态下丙酸的基本产生速率:P=I/(C′V′/CV-1)(4)由于上式中C′、C、V、V′均可测定。因此可用式(4)计算丙酸的基本产生速率。1.5.2瘤胃液相体积本试验采用瘤胃全排空法测定。绵羊自由饮水,并连续饲喂1周后,用真空泵抽空瘤胃前,向瘤胃灌注一定量(2L)的MacLeod等(1984)缓冲液(每升水中含NaHCO3,KHCO3和NaCl各78,38和7g),且最好加热缓冲液使其温度接近瘤胃液的温度(37℃左右),然后迅速用瘤胃取样管(长0.5m)充分搅匀瘤胃内容物后,用真空泵抽出。将抽出的内容物用小型脱水机分离食糜和液体约5min,从测得的液体体积中减去灌注的缓冲液的体积,即为瘤胃液相体积。最后迅速将食糜和除去一定体积后的液体人工混匀成粘稠状迅速灌入瘤胃。本研究取不同时间点(采食前后)测两次,取平均值作为稳态下瘤胃液相体积。1.5.3瘤液丙酸含量在用全排空瘤胃法测定瘤胃液相体积后,继续模拟连续饲喂1周,第8天开始全天采样,每4h采集瘤胃液一次,共采6次,求其丙酸浓度均值,即为方程(4)中的C值。1.5.4稳定性条件:新的浓度水平启动灌注的目的是为了迅速提高瘤胃的丙酸浓度达到一个新的浓度水平,并接上连续灌注后在较短的时间内趋向新的稳定状态。同时也使液相中标记物的浓度趋于稳定。表1列出了启动灌注液中有关指标的计算结果。1.5.5灌注时定位连续灌注的目的是为了使瘤胃的丙酸浓度在启动灌注后稳定在一个新的浓度水平,同时使液相中标记物的浓度趋于稳定。表2列出了连续灌注液的各种指标。1.5.6瘤液的采集和处理晨6:00开始启动灌注,用100ml注射器将分别配制好的启动液迅速灌入瘤胃后,用取瘤胃液样管在瘤胃中充分搅匀,紧跟着连续灌注,3h后开始从瘤胃和小肠取样:取瘤胃液从9:30开始,每隔30min取样1次,直到16:30结束;取小肠液从10:00开始,每隔2h取样1次。瘤胃液的pH值每小时测定1次。连续灌注丙酸溶液在16:30采样后停止,接着灌注水溶液,灌注的速率不变。在停止灌注丙酸溶液后,每小时采集瘤胃液1次,直至20:30结束并停止水的灌注。然后让羊自由采食,至此采样结束。1.6提高丙酸产量的试验1.6.1启动灌注液中丙酸浓度的确定安排5个处理,每个处理代表一个灌注的丙酸水平(RPP,mmol/h)和一次灌注试验。在每一试验中,同测定稳态下丙酸基本产生速率一样,由启动灌注和连续灌注两过程组成。启动灌注液中丙酸浓度的确定原则是通过灌注启动液后使瘤胃液中丙酸的浓度提高到期望的水平,然后通过连续灌注使瘤胃丙酸浓度稳定在一新的较高的水平。表3列出了不同处理下启动液和连续灌注液的具体配制情况。1.6.2灌注液ph的确定为提高丙酸产生速率的丙酸溶液的配制仍使用Macleod等缓冲液,调整灌注液的pH至大约5.7,灌注速率与羊平均的自由饮水速率相当。样品的收集与测定丙酸基本产生量略有区别,即瘤胃液收集的时间间隔从每隔0.5h延长至1h,小肠液每2h收集1次。1.7偏磷酸溶液内标法测定vfa1.7.1瘤胃液样品处理:采集的瘤胃液立即用4层纱布过滤,取5ml瘤胃液和1ml25%的偏磷酸溶液混匀,静置30min,3000r/min下离心10min,直接上机用内标法测定VFA或放-20℃冰箱保存,供以后测定。1.7.2VFA测定用内标法,标记物Co用原子吸收法测定,pH用酸度计现场测定。1.8瘤胃液相体积测定丙酸在瘤胃的消失速率(DIS,mmol/h):DIS(mmol/h)=产生速率(PROD,mmol/h)-流通速率(PSG,mmol/h)(5)丙酸产生速率(PROD,mmol/h):PROD(mmol/h)=丙酸基本产生速率(mmol/h)+连续灌注速率(mmol/h)(6)丙酸流通速率(PSG,mmol/h):PSG(mmol/h)=提高丙酸产量后稳态下丙酸浓度*Co灌注速率(mg/h)/稳态下液相中Co的浓度(mg/L)(7)瘤胃液相流通速率(FRORL,L/h):FRORL(L/h)=Co灌注速率(mg/h)/稳态下液相中Co元素浓度(mg/l)(8)丙酸停止灌注后,瘤胃液相的小数稀释速率(KL,/h)由下列指数曲线计算:Co(t)=Co(0)*Exp(-KL*t)(9)标记法测瘤胃液相体积(VL)的计算公式:VL=瘤胃液相的流通速率(L/h)瘤胃液相的稀释速率(/h)(10)VL=瘤胃液相的流通速率(L/h)瘤胃液相的稀释速率(/h)(10)2结果2.1肿瘤胃基本稳定条件及基本产生率的计算结果2.1.1灌注时间和连续灌注时间对瘤胃ph的影响在启动灌注后,瘤胃内pH短时间内出现一定程度的上升,其后随着连续灌注时间的延续,大约在启动灌注4h后,瘤胃pH开始趋于稳定。动物个体间pH变异系数<0.5%。2.1.2丙酸钠对肿瘤胃的浓度变化大约在启动灌注(晨6:00)后5h后,瘤胃内丙酸浓度开始趋于稳定,动物个体间变异系数均<6%。2.1.3co-印度稳定下肿瘤标记物质的浓度变化在启动灌注后仍出现短时间的Co浓度的升高,而后在连续灌注的维持下,瘤胃标记物浓度趋于稳定,动物个体间变异系数均<5%。2.1.4丙酸产生速率和丙酸消失速率按稳态下瘤胃各种特性指标计算公式[式(5)~(10)],计算得到连续饲喂条件下,且瘤胃丙酸浓度趋于稳定时,瘤胃内各种液相特性指标及丙酸的有关参数列于表4。表4表明,丙酸在瘤胃稳态下的基本产生速率为22.4mmol/h,加上连续灌注的丙酸数量,则总的丙酸产生速率为34.2mmol/h。其中每小时有23.4mmol丙酸被吸收,即产生丙酸的68.3%被瘤胃吸收。产生的丙酸向瘤胃后消化道的周转量为10.8mmol/h,占丙酸产生量的31.4%。丙酸产生速率、丙酸消失速率和丙酸的小数消失率的变异均较小,CV分别为1.9%,4.9%和3.2%。此外,瘤胃液相外流速率为0.253L/h,由标记物估测的瘤胃液相体积为2.49L,与本试验灌注前通过人工全排空瘤胃内容物测定的瘤胃体积非常接近,恰好证实了两种方法的可行性;还测得了瘤胃液相小数外流速率为0.101/h。2.2瘤胃液相标记物co与丙酸发现速率的关系2.2.1提高丙酸产生速率与稳态下瘤胃pH、丙酸浓度及标记物浓度的关系:通过连续灌注丙酸得到5个不同丙酸产生水平(处理),获得的稳态下瘤胃内液相pH、丙酸浓度及液相中Co元素浓度及均值和变异系数见表5。瘤胃丙酸产生速率对瘤胃液相pH的影响:瘤胃丙酸产生速率PROD(mmol/h)与瘤胃pH呈线性关系,对所有处理进行回归分析得如下结果:pH=6.87-0.0059·PROD(mmol/h)(R2=0.96,P=0.0028,CV=0.86%)(11)瘤胃丙酸产生速率对瘤胃丙酸浓度的影响:对不同处理间的均值作回归处理得到瘤胃丙酸浓度CON丙酸(mmol/L)与PROD(mmol/h)的线性模型如下:CON丙酸(mmol/L)=3.41+1.079·PROD(mmol/h)(R2=0.99,P=0.001,CV=2.86%)(12)丙酸产生速率对瘤胃液相标记物Co浓度的影响:随着丙酸产生速率的增加,瘤胃液相中Co浓度呈线性下降趋势,对不同处理间的均值作回归处理得到瘤胃Co元素浓度Co(mg/L)与PROD(mmol/h)的回归模型如下:Co(mg/L)=18.57-0.038·PROD(mmol/h)(R2=0.9652,P=0.003,CV=2.32%)(13)2.2.2丙酸产生速率对丙酸流通速率、丙酸消失率(即吸收率)及液相外流速率等之间的数量关系及统计分析结果,见表6。丙酸产生速率对丙酸消失率的影响:对5个处理的丙酸绝对消失速率(mmol/h)进行统计分析表明:丙酸产生速率极显著影响丙酸消失速率(P=0.0001),多重均值检验(DUNCAN检验)表明,处理间差异显著。且瘤胃丙酸产生速率与丙酸消失率的数量关系如下:DIS(mmol/h)=-0.8+0.705·PROD(mmol/h)(R2=0.99,P=0.001,CV=1.59%)(14)丙酸产生速率对丙酸小数消失率的影响:丙酸产生速率的增加对丙酸小数消失速率(/h)无显著影响(P>0.05)。丙酸产生速率对瘤胃液相外流速率(RFL,L/h)的影响:随着丙酸产生量增加,瘤胃液相外流速率(L/h)也随之有一定程度增加,两者呈线性关系(R2>0.90)。不同处理间丙酸产生速率(mmol/h)与RFL(L/h)的线性方程为:RFL(L/h)=0.2205+0.000255·PROD(mmol/h)(R2=0.9327,P=0.0076,CV=1.39%)(15)丙酸产生速率对瘤胃液相稀释速率(/h)无明显变化(P=0.67)。丙酸产生速率对瘤胃液相体积(VL,L)的影响:随着丙酸产生量的增加,瘤胃液相外流速率(L)也随之有一定程度增加,但是处理间均值差异不显著(P=0.373)。2.3瘤胃丙酸对pdr的影响丙酸在十二指肠中的流通量的计算:PDR(mmol/h)=稳态下十二指肠中丙酸浓度(mg/L)*Co灌注速率(mg/h)/稳态下液相中Co的浓度(mg/L)丙酸在十二指肠中的各种特性指标的计算结果均列在表7中。丙酸产生速率对PDR的影响:表7数据表明,随着瘤胃丙酸产生速率的增加,在小肠液中的丙酸流通量也有小幅度增加,两者成线性关系(R2>0.99,P=0.001)。将进入十二指肠丙酸的流通量转换为占进入后消化道总的丙酸的比例后,所得数据列在表7中。对转化后的小数比例数据进行统计分析表明,瘤胃丙酸产生速率对这一比例影响不显著(P=0.197),说明小肠中丙酸的流通量占整个流入后消化道的丙酸总量的比例基本恒定,不受瘤胃丙酸产生量多少的影响。由此间接反映了羊的瓣胃和真胃具有对丙酸较强的吸收能力,能够除去来自瘤网胃96%~98%的丙酸。3非灌注状态下瘤胃vfa的变化通常一日2次的饲喂制度反映了正常的生理干扰,表现在引起瘤胃VFA浓度、液相流通速率及瘤胃液体积等指标的变化,往往给定量研究带来困难。本研究依赖选择合适的动物、模拟连续饲喂和数学模型来评定动态的、且不能直接测定的生物过程。具体操作是按维持饲喂营养水平,精、粗饲料比为44∶56,并等份按8次饲喂而获得。其结果用做定义丙酸浓度的稳态条件。借助于测定稳态下在不同测定部位的丙酸浓度和标记物Co元素浓度,利用瘤胃消化动力学数学模型估测丙酸的消失率、流通量及液相流通量和体积等成为可能。测定丙酸在瘤胃部位的产生量要求在瘤胃发酵稳态状态下进行。而在非稳态下进行的丙酸产量的研究报道较少出现一致的结果。本研究中给动物饲喂54%的干草混合日粮,测得的瘤胃内源丙酸产生速率为22.4mmol/h,折算为日产丙酸的数量为538.3mmol/d。而稳态下(非灌注状态下)瘤胃VFA的摩尔比例为54.38∶27.87∶17.75,转化为瘤胃乙、丙、丁酸的产量为293,150和96mmol/d,则VFA的总能为693.94KJ,占每日摄入代谢能的15.4%左右,比Peters等用肉牛研究报道的值高约2个百分点。由于丙酸的碳原子与其它VFA之间的交换已经定量不显著,所以本研究用稳态下非标记酸灌注确定的丙酸产生速率能反映瘤胃丙酸的产生速率。尽管Bath等推测未缓冲的VFA的灌入不会改变瘤胃VFA的发酵模式,但是Peters用体外法的研究发现,当培养液的pH值从6.7降至5.7时,明显降低丙酸的产生量。因此,本研究灌入通过MacLeod缓冲液缓冲过的丙酸溶液,其目的是减少瘤胃内源发酵模式程度至最小,尤其保证当灌入的丙酸速率与瘤胃的基本