实时荧光定量pcr检测msn基因在藏系绵羊组织中的表达

实时荧光定量pcr检测msn基因在藏系绵羊组织中的表达

绵羊是青藏高原的古老动物之一。山羊的热量、通常的营养成分、氨基酸含量和必要的氨基酸含量都很高。肌肉和口感很好，属于高质量的肉。肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)是近年来发现的一种骨骼肌特异性生长因子,属于生长因子超家族成员之一。MSTN是骨骼肌生长的负调控因子,特异性的抑制骨骼肌细胞的增殖和分化,是肌肉生长发育的重要因素。研究发现,将不同浓度的外源性表达的MSTN蛋白质加入到C2C12成肌细胞的培养物中,随着MSTN浓度的增加,成肌细胞的繁殖速度相应减慢。这表明,MSTN表达量的升高会造成肌肉生长速度的下降。为了提高藏绵羊的产肉量及改善肉质,需削弱或消除MSTN的负调控作用。因此,如何干扰肌肉生长抑制素的表达和功能,生产具有更多肌肉、更少脂肪的家畜,提高家畜产肉性能的研究意义重大。为此,笔者通过实时荧光定量PCR的方法检测了MSTN基因在藏系绵羊不同时期、不同组织的表达差异。1材料和方法1.1材料表面1.1.1试验动物用高压灭菌的剪刀取刚屠宰的羔羊以及6、9、12月龄的藏系绵羊各2只的腿肌、心肌、瘤胃和真胃组织,迅速放入液氮罐中带回实验室。1.1.2pcr试剂和仪器SYBRue617PrimeScriptTMRT-PCRKit(PerfectRealTime购自TaKaRa(大连)公司;Trizol等RNA提取试剂和反转录试剂盒购自TaKaRa公司;E.Z.N.A.TMGelExtractionKit购自美国OMEGA公司。梯度PCR仪购自德国Biometra公司;GELDOC2000凝胶成像系统购自美国BIO-RAD公司;CFX96TM实时荧光定量PCR仪购自美国BIO-RAD公司;WAPBiowave核酸蛋白检测仪购自英国Biochrom公司。1.2方法1.2.1总rna提取取液氮保存的组织约100mg用Trizol法提取总RNA。分别吸取5μl总RNA溶液,采用分光光度计测定A260/A280、A260/A230以及浓度;采用1%琼脂糖凝胶电泳检测所提取的总RNA质量。检测完成后将总RNA溶液迅速置于超低温冰箱中(-80℃)保存。按PrimeScriptTMRTreagentKit试剂盒(TaKaRa公司)说明,合成第1条cDNA链,-20℃保存。1.2.2引物的设计与合成参照GenBank公布的绵羊MSTN序列(NM_001009428.1)和β-actin序列(NM_001009784.1),采用Primer5.0在其保守区域各设计一对引物,由Invitrogen公司合成。2个基因的引物序列见表1。1.2.3mstn和-actin基因表达分析按照E.Z.N.A.TMGelExtractionKit,分别对MSTN和β-actin基因的PCR产物进行DNA凝胶回收纯化。以纯化后产物为模板,按10倍梯度稀释8个标准,再按照预先筛选优化的QT-PCR反应体系及反应条件进行扩增。反应结束后软件自动导出扩增动力学曲线、溶解曲线、循环阈值(Cyclethreshold,Ct值)、扩增效率、标准曲线决定系数以及直线方程的斜率。再以相同反应体系及反应条件对组织中MSTN和β-actin基因进行定量分析。具体反应体系为:RNAaseFreeddH2O8.5μl,10μmol/L上、下游引物各1.0μl,2×SYBRPremixEXTaq12.5μl,cDNA模板2.0μl,共25.0μl。MSTN反应条件为:95.0℃10s(预变性);95.0℃5s,58.0℃30s,40个循环;95℃10s;65.0~95.0℃升温0.5℃/s(PlateRead)。β-actin反应条件为:95.0℃10s(预变性);95.0℃5s,54.0℃30s,40个循环;95℃10s;65.0~95.0℃升温0.5℃/s(PlateRead)。以β-actin为对照,对MSTNmRNA表达水平进行校正。采用Pfaffl法计算MSTN基因不同年龄及不同组织的表达量差异。2结果与分析2.1rna的降解所提取总RNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测后可见较清晰的RNA带:28S、18S和5S,其中5S带较浅,表明RNA无明显降解(图1)。经紫外分光光度计检测,A260/A280比值在1.8~2.0,表明RNA纯度较高。2.2实时荧光定量pcr的标准曲线采用1%琼脂糖凝胶电泳检测标准品,可见较清晰的特异性扩增条带:β-actin基因的部分片段,103bp;MSTN基因的部分片段,186bp(图2)。条带清晰且无杂带,可用于建立标准曲线。成功建立了β-actin和MSTN基因实时荧光定量PCR的标准曲线(图3、4),其中MSTN基因的标准曲线方程为:Y=-3.474X+33.114,r2=1.000。式中,Y代表Ct值;X代表模板量的对数值。其线性范围可达6个数量级,Ct值和起始模板拷贝数的相关性均较好(r=1.000),标准曲线的斜率接近理想值-3.320,扩增效率为94.0%。β-actin基因的标准曲线方程为:Y=-3.348X+30.820,r2=1.000,扩增效率为98.9%。可见,标准品的稳定性、重复性好,可靠性高,可对MSTN基因表达进行准确定量的实时荧光定量体系。2.3mrna基因的相对表达水平2.3.1mtn基因在养羊业各组织中的表达分别对藏绵羊真胃、瘤胃、腿肌和心肌组织中MSTN基因表达进行定量扩增。由图5可知,MSTN基因在藏绵羊真胃、瘤胃、腿肌和心肌中的相对表达量分别为0.0022、0.0017、6.7741和0.0112,腿肌中MSTN基因平均表达量是瘤胃的3984.78倍,是心肌的602.69倍,说明腿肌MSTN的表达明显高于其他组织,且差异极显著(P<0.01)。2.3.2mstn基因表达由于MSTN基因在腿肌的相对表达强度明显高于其他组织,分别对不同年龄段藏绵羊腿肌中MSTN基因定量扩增结果进行分析。由图6可知,在藏绵羊的腿肌组织中,12月龄的MSTN基因表达量最高,相对表达强度为1.0000;6月龄次之,其相对表达强度为0.8795;MSTN基因在9月龄时相对表达强度为0.6543;羔羊腿肌MSTN基因的相对表达量最低,为0.2542,仅为12月龄的25.42%。可见,MSTN基因在不同年龄间的表达量有一定差异。统计学检验表明,12月龄时与6、9月龄时相比有一定差异,但差异不显著(P>0.05);与羔羊时相比差异显著(P<0.05)。2.3.3mstn基因在不同年龄间的表达差异分别对不同年龄段藏绵羊真胃、瘤胃、腿肌和心肌4个组织MSTN基因进行定量扩增,并综合4个组织分析MSTN基因在不同年龄段的表达。由图7可知,综合4个组织后6月龄藏绵羊的MSTN基因表达量最高,相对表达强度为1.3003;9月龄次之,相对表达强度为0.9952;而MSTN基因在羔羊与12月龄间的表达量无显著差异,表达强度分别为0.5810和0.5167。MSTN基因在不同年龄间的表达量有一定差异,统计学检验表明6月龄与9月龄、6月龄与12月龄、6月龄与羔羊之间以及9月龄与12月龄、9月龄与羔羊之间MSTN表达量均有显著差异(P<0.05);12月龄与羔羊之间MSTN基因的相对表达强度差异不显著(P>0.05)。2.3.4mstn基因表达情况对相同组织不同年龄间MSTN基因的相对表达进行了比较分析。图8显示,MSTN基因在各组织不同时期的表达水平均有差异。真胃组织中9月龄MSTN基因表达量最高;12月龄次之;羔羊和6月龄藏绵羊表达水平较低,但二者无显著差异。羔羊瘤胃MSTN基因明显高于其他组织,且差异显著(P<0.05)。心肌组织中以羔羊的MSTN基因表达量最高。MSTN基因在腿肌的相对表达强度明显高于其他组织,同时体现出腿肌中MSTN基因在不同时期的表达差异。综合看来,MSTN基因在腿肌中表达量最高,心肌中有少量表达,真胃和瘤胃中表达极其微少。3讨论3.1实时荧光定量pcr技术核酸的精确定量一直是科学家们所关注的问题之一,自PCR发明以来人们一直用其进行核酸精确定量,发展了Northern印迹法、半定量RT-PCR及竞争性RT-PCR等,然而这些方法在准确度和灵敏度方面均存在不足。其中实时荧光定量PCR技术解决了传统RT-PCR技术只能对终点检测的局限问题,实现了每一轮循环都能检测荧光信号的强度变化,并经软件处理实现了对整个PCR过程的实时监测。实时荧光定量PCR技术的建立实现了PCR从定性到定量的飞跃,在PCR反应过程中可根据检测到的荧光量的变化实时检测产物扩增量,根据相关数学模型的建立能够准确地对目的基因初始模板量进行绝对定量和相对定量分析。该研究采用了比Northern印迹法灵敏且与半定量RT-PCR和竞争性RT-PCR相比更为灵敏、省力的实时荧光定量方法。3.2设立标准曲线,进行定量检测实时荧光定量PCR体系标准品的选择是多样的,以组织或细胞RNA为检测样本时可用经逆转录所获得的cDNA作为标准品;还可直接将靶基因的扩增产物作为标准品;此外,还可将靶基因扩增片段转入质粒中构建成质粒标准品,在经系列稀释后制备标准曲线;在对样本中的病原微生物如病毒进行定量检测时,还可直接用病毒颗粒作为标准品制作标准曲线。该试验采用靶基因的扩增产物作为标准品,是因为其较cDNA稳定,同时保证了标准品同检测样品扩增效率的一致性,且简便易得。3.3mstn的表达提高了临床上的产肉性能,并使其相对表达肌肉生长抑制素是骨骼肌生长发育的重要生长因子,杨威研究表明,重组肌肉抑制素对于成肌细胞的增殖过程具有极强的抑制作用。由重组蛋白质制备的抗体能够特异性地识别人、小鼠、大鼠和鸡肌肉组织的内源肌肉抑制素。Kim等通过MSTN成熟肽基因原核表达制备了单克隆抗体,使雏鸡体重比对照组增重4.2%,肌肉增重5.0%。此外,利用体外注射抗MSTN单克隆抗体以阻断体内MSTN的方法,可有效改善Duchenne型肌营养不良小鼠模型的症状,并恢复其肌肉功能。有研究表明,给成年大鼠注射肌肉生长抑制素抗体后发现不但肌肉量增加了,而且肌力也相应得到了提高。“双肌牛”的表型特征不仅表现在其臀部、大腿、上臂、胸部及起支撑作用的中前端肌肉群异常发达、肌肉量多,而且表现在其皮肤薄、皮下脂肪少,有更多的脂肪沉积于肌纤维之间,在提高了瘦肉率的同时也改善了肉质。由此可见,通过适当方法阻断MSTN的作用途径能够有效促进肌肉的生长和发育、减少脂肪分化,对于提高藏绵羊的产肉量与产肉性能方面具有极其重要的应用价值。通过该研究建立的SYBRGreenⅡ实时荧光定量PCR检测MSTNmRNA相对表达水平的方法,可对藏系绵羊不同年龄各组织器官中的MSTNmRNA进行相对定量测定,进而确定MSTNmRNA表达的水平。为研究藏绵羊各组织肌肉生长抑制素的表达及其表达时期提供了更加便捷、可靠的途径,也为进一步利用MSTN抗体阻断MSTN的作用通路进而提高家畜生产性能、改善肉质提供了分子生物学依据。试验结果表明,藏绵羊MSTN基因在骨骼肌中大量表达,心肌中有少量表达,在瘤胃和真胃即在平滑肌中几乎不表达。证实了MSTN是一种骨骼肌生长的负调控因子,而与平滑肌的生长关联不大,这与早期学者对MSTN的研究结果相一致。此外,藏绵羊MSTN基因的相对表达量在6月龄时达到最高,9月龄与6月龄相比表达量有所减少