分子标记辅助育种在作物育种上的应用

分子标记辅助育种在作物育种上的应用

随着现代生物学的发展，现代生物技术为作物育种提供了强有力的工具。分子标记辅助选择（mas）是其中一项重要的技术。这不仅弥补了传统选择技术在作物育种中的缺陷，而且加速了育种过程。分子标记辅助育种的概念最早是由Lande和Thompson提出,它是将分子标记应用于作物改良的一种手段,其基本原理是利用与目标基因紧密连锁或表现共分离的分子标记对选择个体进行目标以及全基因组筛选,从而减少连锁累赘,获得期望的个体,达到提高育种效率的目的。分子标记辅助选择是分子标记技术用于作物改良的重要领域,是传统育种技术和现代生物技术相结合的产物。1利用分子标记进行农艺性状的检测大量理论研究发现,MAS比以表现型为基础的选择更有效率,它不仅针对主基因有效,针对数量性状位点(QTL)也有效;不仅针对异交作物有效,针对自花授粉作物也有效。MAS的优越性可以体现在以下方面:1.1可以在植物发育的任何阶段进行选择,对目标性状的选择不受基因表达和环境的影响,可在早代进行准确的选择,加速育种进程,提高育种效率;有很多重要性状(如产量和后期叶部或穗部病害抗性等)只有在成熟植株上才能表现出来,因此采用传统方法在播种后数月或数年均不能对其进行选择。而利用分子标记就可以对幼苗(甚至对种子)进行检测,从而大大节省培育植株所浪费的人力、物力和财力。1.2共显性标记可区分纯合体和杂合体,不需下代再鉴定,而且在分离世代能快速准确地鉴定植株的基因型。因而对分离群体中目标基因的选择,尤其是对隐性农艺性状的选择十分便利1.3可有效地对抗病性、抗逆性和根部性状等表型鉴定困难的性状进行基因型鉴定。有些表型如抗病虫性、抗旱性或耐盐性等只有在不易界定或控制的特定条件下才能表现出来。在育种项目的初期,育种材料较少,不允许做重复鉴定,或要冒一定风险。利用分子标记技术则可克服基因型鉴定的困难。1.4可聚合多个有利基因提高育种效率。基因聚合(genepyramiding)就是将分散在不同品种(材料)中的有用基因聚合到同一个基因组中,基因聚合育种就是通过传统杂交、回交、复交技术将有利基因聚合到同一个基因组,在分离世代中通过分子标记选择含有多个目标基因的单株,从中再选出农艺性状优良的单株,实现有利基因的聚合,大大提高了育种效率。1.5克服不良性状连锁,有利于导入远缘优良基因。在回交育种时,可有效地识别并打破有利基因和不利基因的连锁,快速恢复轮回亲本的基因型。对于一些主效基因,利用回交结合MAS的方法,可以容易地将这些基因转移到轮回亲本中。2影响mas选择效率的因素MAS虽是提高选择效率的一种有效方法,但由于MAS研究涉及的内容广泛,影响MAS选择效率的因素较为复杂,有很多遗传的和生物学的因素影响其效率,包括标记与基因之间的距离、目标性状的遗传率、群体大小、选用分子标记数目以及选择世代等。2.1标记选择的可靠性回交选择程序中的分子标记辅助选择技术可分为前景选择(foregroundselection)和背景选择(backgroundselection)。前景选择是在对回交群体的选择中,通过对转入受体中的与供体优良基因座位紧密连锁的标记或基因内标记的检测,从而筛选出携带目标基因的单株。前景选择的准确性主要取决于标记与目标基因的连锁强度,标记与基因连锁得愈紧密,依据标记进行选择的可靠性就愈高。若只用一个标记对目标基因进行选择,则标记与目标基因连锁必须非常紧密,才能达到较高正确率。理论上,在F2代通过标记基因型MM选择目标基因型QQ的正确概率P和标记与基因间重组率r有如下关系:P=(1-r)2,若要求选择P达到95%以上,则r不能超过2.5%,当r超过10%时,则P降至81%以下。如果用两侧相邻标记对目标基因进行跟踪选择,可大大提高选择正确率。在单交换间无干扰的情况下,在F2代通过标记基因型M1M1和M2M2选择目标基因型QQ的P值和r有如下关系:P=(1-r1)2(1-r2)2/[(1-r1)(1-r2)+r1r2]2,即使r1、r2均达20%时,同时使用两个标记P值也仍可达88.5%。潘海军等在水稻MAS(Xa23)中,用单标记RpdH5和RpdS1184的准确率分别为91.10%和87.13%,同时使用这两个标记MAS准确率则达99.0%,可见双标记选择效率比单标记高。此外,重组值r也影响到由该标记位点等位基因分离产生遗传方差的大小,r值越小,遗传方差越大,数量性状的选择效率越高。2.2性状遗传率对mas效率的影响性状的遗传率极大地影响MAS选择效率。遗传率较高的性状,根据表型就可对其实施选择,此时分子标记提供的信息量较少,MAS效率随性状遗传率增加而显著降低。在群体大小有限的情况下,低遗传率的性状,进行MAS的相对效率较高,但存在一个最适的群体大小,在此限之下MAS效率会降低。如遗传率在0.1~0.2时,MAS效率会更高,但出现负面试验频率也高一些(如QTL检测能力下降等)。因此,利用MAS技术所选性状的遗传率应在中度(0.3~0.4)为好。2.3mas群体大小群体大小是制约MAS选择效率的重要因素之一。一般情况下,MAS群体大小不应小于200个。选择效率随着群体增加而提高,特别是在低世代,遗传率较低的情况下尤为明显,所需群体数的大小随QTL数目的增加呈指数上升。2.4标记数对mas效率的影响理论上标记数越多,从中筛选出对目标性状有显著效应标记机会就越大,因而应有利于MAS。事实上,MAS效率随标记数增加先增后减。MAS效率主要取决于对目标性状有显著效应的标记,因而选择时所用标记数并非越多越好。Gimelfarb和Lande的研究表明,利用6个标记时,MAS效率明显高于3个标记,但用12个甚至更多时,MAS效率在低世代时反而降低,在高世代时增幅很小。一条染色体上有多个标记时,存在一个最适标记密度,在此之上则相对效率降低。2.5各时代背景选择的优化回交育种中除了目的基因的转移外,主要目标是尽可能快速地恢复轮回亲本基因组。对基因组中除了目的基因之外的其它部分的选择,即背景选择(BackgroundSelection)。背景选择目标之一是减少目标等位基因载体染色体上供体基因组的比例;目标之二是减少非目标等位基因载体染色体上的供体基因组。背景选择尽可能覆盖整个基因组,进行全基因组的选择。在早代变异方差大,重组个体多,中选几率大。因此背景选择应在育种早期世代进行,随着世代的增加,背景选择效率会逐渐下降。在早期世代,分子标记与QTL的连锁非平衡性较大;随着世代的增加,效应较大的QTL被固定下来,MAS效率随之降低。2.6标记选择的影响模拟研究发现,随着QTL增加,MAS效率降低。当目标性状由少数几个基因(1~3)控制时,用标记选择对发掘遗传潜力较为有效;然而当目标性状由多个基因控制时,由于需要选择世代较多,加剧了标记与QTL位点间的重组,降低了标记选择效果;在少数QTL可解释大部分变异的情况下,MAS效率较高。3分子标记的辅助选择前提和基础3.1建立标记连锁图谱分子标记连锁图谱也称为“框架图谱”,因为真正的基因将被定位于这个图谱上。进行基因定位时,需要构建将分子标记以线性形式排列的标记连锁图谱,显然只有建立相对饱和的连锁图谱,才能进行基因的精细定位。目前在水稻、玉米、小麦、大麦、番茄、马铃薯等多数作物上都建立了相当饱和的遗传图谱。3.2目标性状基因与标记的重组率基因标记(genetagging)即是建立目标基因与分子标记之间的连锁关系。分子标记辅助选择的可靠程度取决于目标性状基因座位与标记座位之间的重组率,可见二者之间的距离越近越好。如果在目标基因的两侧均能找到与之连锁的标记会大大提高选择的可靠性。值得注意是目标性状与标记座位间的重组率在不同的群体中有一定的差异,且往往目标性状的标记群体不是育种群体,因此在实际应用中,要求用于辅助选择的分子标记与目标性状的重组率必须较低3.3rapd和ssr标记方法在育种实践中的应用植物育种中可利用的分子标记有许多种,常用的有RFLP、RAPD、SSR和AFLP等。RFLP、SSR和AFLP,大多是共显性标记,可区分纯合和杂合型。其中基于分子杂交的RFLP分析需要的总DNA多,检测过程复杂,而且费用大,难以在育种实践中推广应用;RAPD需要DNA量少,分析程序简单,但大多是显性标记,不能区分纯合和杂合型,且重复性差,在实际应用中也存在一定的局限;AFLP的优点是多态性好,准确性高,灵活性强,但它的分析程序较复杂,而且成本较高,一般的育种单位难于接受。SSR则结合了前面三种方法的优点,需要DNA量较少,多态性好,分析程序简单,重复性较高以及成本相对较低,是分子标记辅助育种中较理想的一种分子标记。在实际育种实践中,要根据实际情况选择使用分子标记,而以上选择标准也并非绝对。例如有的RAPD标记在某些植物分析中表现出共显型,且重复性很好,就可以用于标记辅助选择。总之,用于分子标记辅助育种的标记最好是基于PCR技术的分子标记,成本较低,技术较简单,在两个亲本之间有较好的多态性且带型清晰。4代理选择技术的应用研究4.1在对作物回交繁殖的研究中，分子标记的应用4.1.1玉米花叶病毒的mv1基因定位分子标记辅助选择技术利用与目标基因紧密连锁的分子标记对是否带有目标基因的单株进行前景选择,大大加快了育种进程。Ming等把抗玉米花叶病毒(MMV)的mv1基因定位在第3染色体上后,利用RFLP标记PHP20508和UMC102作辅助手段把抗病基因转移到30个感病自交系中,既降低了成本,又缩短了时间。Hansen等利用4个RAPD标记,在10个BC1F2家系的4605个单株中快速选出了oguCMS恢复位点纯合的906个单株,此法大大节省了测交的工作量及时间,充分展现了分子标记辅助选择的优越性。4.1.2分子标记连锁图在回交育种中,分子标记辅助选择技术可以快速选出以轮回亲本基因组为主要遗传背景的单株。孟金陵等认为,通过分子标记辅助选择技术,借助于饱和的分子标记连锁图,对各选择单株进行整个基因组的组成分析,进而可以选出带有多个目标性状而且遗传背景良好的理想个体。Tanksley等通过计算机模拟分析,结果表明,如果从每个回交世代含有目标基因的30个单株中,通过分子标记辅助选择选出1株带有轮回亲本基因组比率最高的个体作为下一次回交的亲本,则几乎完全恢复到轮回亲本基因组的基因型只需3代,而在传统的育种方法中,要达到99%的轮回亲本恢复比率则需要6.5±1.7代。4.1.3分子标记辅助选择在回交育种中,连锁累赘现象是影响回交育种的一个主要限制因素。传统的解决方式一般是通过扩大选择群体或增加回交次数来解决。Stam等的研究表明,即使回交20代后,还能发现相当大的与目标基因连锁的供体染色体片段,而在大多数植物基因组中10cM的DNA序列足够包含数百个基因。通过分子标记辅助选择可以快速减轻连锁累赘。Tanksley等的研究表明,用位于目标基因两侧1cM的两个分子标记进行辅助选择,通过两个世代就可获得含目标基因长度不大于2cM的个体。这样的结果如果采用传统的育种方式则需要100代才能达到。因此,分子标记辅助选择可以对目标基因附近发生了重组的个体进行鉴定。4.2分子标记辅助鉴定基因聚合是将多个有利基因通过育种途径聚合到一个品种(材料)之中,使其在多个性状上同时得到改良,产生更有实用价值的育种材料。在抗病育种中经常应用基因聚合技术,育种家将多个控制垂直抗性的基因聚合在同一品种中可以提高作物抗病的持久性。在传统的抗病性检测中,通过接种鉴定不仅程序复杂,而且常常影响植株的生长发育,加之一些抗性基因很难找到相应的鉴定小种。采用与抗性基因紧密连锁的分子标记或相应基因的特异引物进行分子标记辅助选择,可加速抗源筛选和抗性基因的鉴定,提高育种选择效率,缩短育种周期。特别是在多个抗性基因的聚合选育和转移数量抗性基因方面具有广泛的应用前景。Huang等.用RFLP和PCR标记在一个分离群体中筛选出同时含有4个抗白叶枯病基因Xa4、Xa5、Xa13和Xa21的单株。柳李旺等利用与CMS恢复基因Rf1紧密连锁的3个SSR标记和Bt基因的PCR标记开展分子标记辅助选择,培育聚合有Rf1和Bt的转基因抗虫棉恢复系。何光明等采用分子标记辅助选择与生物学鉴定相结合的方法,将IPT基因与Xa23及抗稻瘟病基因进行聚合,最终在4个水稻BC2F1回交组合中获得了7株携带IPT基因与Xa23基因的植株。4.3抗旱性标记的分子图谱的建立作物中大部分的农艺性状是由多基因控制的数量性状,每个基因对目标性状只表现微效作用,没有明显的显隐性之分,而且表现型受环境条件影响很大,因而采用传统的育种途径对这些性状进行选择有较大的难度。分子标记辅助选择为数量性状的改良提供了新的研究思路。Paterson等认为高密度分子遗传图谱的建立,使覆盖全基因组的分子标记将控制数量性状的微效多基因分解成孟德尔遗传因子,并定位到分子标记所在的染色体上,进而按照经典遗传模式进行研究。这就使得利用与QTL紧密连锁的分子标记对这些QTL进行转移以达到对这些数量性状的改良成为可能。CIMMYT于1994年开始玉米耐旱性的标记辅助选择,对不耐旱的高配合力自交系CML247进行改良。用耐旱供体与其杂交,然后在回交2代自交2代过程中,利用已鉴定的和耐旱性有关的QTL在5个染色体区域进行辅助选择,将得到的70个BC2F3用2个测验种测交。结果这70个测验种的产量在干旱条件下的均值显著高于对照(未改良CML247的测交组合);在水分充足条件下产量没有下降。Jean-Marcel介绍了MAS的实例和取得的进展,在改良多基因控制的数量性状方面,如抗玉米条纹病毒(MSV)和耐旱育种,把控制数量性状的主效QTL转入目标自交系,获得了良好的预期效果。5标记辅助选择、杂交亲本保护与育种群体近十多年来,分子标记辅助育种已