基因突变的筛选与鉴定完整版

1基因突变的筛选与鉴定

基因突变研究首先面临的问题就是如何收集到特定类型的突变体。遗传学家采用两种办法解决这个问题：一是设计特定的选择系统（selectivesystem）从群体中检出理想的突变型；二是利用诱变剂（mutagen）增加突变发生频率。2一、微生物基因突变的筛选与鉴定◆选择培养法（selectiveculture）

根据野生型与突变型在不同培养基、培养条件中的生长能力差异来筛选突变型；也是微生物遗传重组研究中鉴定重组型的基本方法。3生化突变及相关概念◆生化突变：◆野生型(wildtype)与原养型(prototroph)★野生型★原养型◆营养缺陷型(auxotroph)：最低营养素如：Lys+和Lys-41.红色面包霉生化突变的鉴定方法◆突变的诱发：◆突变的筛选：

◆突变的鉴定：★

突变的真实性：★

突变的类型(哪类型营养缺陷型突变？)： 氨基酸？

(加入各种氨基酸)不能生长。 维生素？

(加入各种维生素)能够生长。★进一步鉴定具体类型：

硫胺素(VB1)、吡醇素(VB6)、泛酸、肌醇。5红色面包霉生长突变的诱发和鉴定完全培养基基本培养基10.基本media8：+维生素9：+氨基酸硫胺素一个子囊果基本培养基不生长11完全media一个分生孢子交配n和2n在哪里？一个子囊孢子获得了什么？吡哆醇泛酸肌醇62.◆野生型红色面包霉能在基本培养基上正常生长。◆几种生化突变型：★突变型a：精氨酸 (精氨酸合成缺陷型)；★突变型c：精氨酸或瓜氨酸 (瓜氨酸合成缺陷型)；★突变型o：精氨酸、瓜氨酸或鸟氨酸

(鸟氨酸合成缺陷型)。◆精氨酸是必需氨基酸，合成途径：73.◆Beadle,G.W.(1941)：基因是通过酶的作用控制性状表现，提出“一个基因一个酶”假说(如图所示)。8Beadleinlabcoat.AndEdwardL.Tatum

1958NobelPrize9二、植物基因突变的鉴定

（1）突变真实性的鉴定◆一致的环境条件下种植：野生型、突变型◆性状考察与比较分析(进行方差分析)；◆根据试验结果进行判定：★两类个体间没有差异★差异仍然存在◆分子水平鉴定方法

10（2）突变显隐性的鉴定隐性突变可利用杂交试验加以鉴定例如：高杆——矮杆：隐性？杂交F1

显性？11（三）突变率的测定体细胞突变频率一般是根据M2出现的突变体比例估算。例如，在M2群体的10万个个体数中出现5个突变体，突变频率为5×10-5。122.斯特得勒花粉直感13

花粉直感法测定突变(诱变)率玉米籽粒胚乳：非甜(Su)

甜(su)P: 甜粒亲本(susu)×非甜粒亲本(SuSu)G: su SusuF1: Susu(非甜) susu(甜粒)

正常花粉粒后代 突变花粉粒后代亲本配置：具有花粉直感特征；性状显隐性差异明显；亲本具有相对性诱变处理14（四）谷类作物种子诱发隐性突变鉴定（例）1个分蘖A-a突变植株M1种2种3（1）突变穗（2）2个穗行（3）1个穗行（4）1个穗行（5）其他未突变穗一穗一行目的：获得隐性突变系，突变率？M1的一个隐性突变，M2、M3的表现如何获得隐性纯系（世代、表型）？AAAAAa15三动物基因突变的筛选与鉴定高等动物基因突变筛选与鉴定面临与高等植物相似的困难——群体规模、性状表现及检测手段限制。16一个上睑下垂显性突变的家系分析第二版？知道突变：何时？显性17动物基因突变的筛选与鉴定在家系分析上，传统上强调“门当户对”和保持王室血统“纯洁”的欧洲王室贡献了最经典的分析资料。如X染色体上卟啉代谢基因突变引起的伴性遗传血友病等。1819重点？中等难度以下繁杂、理解、清楚记住重点，其他理解20第五节基因突变的分子机制◆经典遗传学认为：★基因是染色体上的一个点。◆现代基因概念认为：★基因是DNA分子带有遗传信息的碱基序列区段；★座位(site)：bp★位点(locus):gene21DNA损伤（lesion/damage）校正修复机制前突变损伤（premutationlesion）修复差错22◆根据基因结构的改变方式：1.碱基替换转换（transition），颠换（transversion）一基因突变的方式231.碱基替换2.缺失突变3.插入突变重复（repeat）移码（frameshift）移码突变：非3bp的倍数24

分子结构改变：碱基替换和倒位突变方式移码：碱基的缺失、插入

…GAAGAAGAAGAA…↓

…GGAAGAAGAAGAA…25例：基因突变的类型26“Robinow-Sorauf型尖头并指(趾畸形)”272829◆1.密码简并性CUAUUA都是亮氨酸◆2.回复突变

◆3.抑制突变基因内抑制基因间抑制◆4.二倍体和多倍体◆5.致死和选择二、突变的防护机制核心是防护！30三DNA修复与差错错配修复（mismatchrepair）、直接修复（directrepair）、切除修复（excisionrepair）、双链断裂修复（double-strandbreakrepair）、重组修复（recombinationrepair）DNA分子结构完整性碱基序列完整性修复！31（一）错配修复（mismatchrepair）：酶修复系统识别杂种DNA分子中双螺旋结构异常的错配位点。错配修复的基本过程为：①修复系统识别杂种DNA分子中双螺旋结构异常的错配位点。②切除错误碱基。③进行修复合成并封闭DNA链切口。许多酶参与错配修复，如大肠杆菌有MutS、MutL、MutH以及DNA聚合酶、连接酶。32(二)直接修复：1.光修复

★

UV照射能引起很多变异：5，6位胸腺嘧啶二聚体(╥)；水合胞嘧啶胞嘧啶氨基对位的那个氮是一号位，羰基的碳是二号位33巡回酶(patrolingenzyme)：如：光激活酶(photoreactingenzyme)蓝色光波光修复过程34碱基烷基化◆烷化剂？去烷基化（dealkylation）酶烷基转移酶（alkyltransferase）甲基转移酶（methyltranferase）。2.去烷基化35DNA单链断裂DNA连接酶催化双螺旋结构中单链断裂处形成磷酸二酯键单链断裂只需要在DNA连接酶的作用下就可以直接修复。3.单链断裂修复单链的的化学键？36◆大肠杆菌中的UVrA突变体的修复过程由四种酶来完成核酸内切酶核酸外切酶DNA聚合酶连接酶暗修复(darkrepair)，或切除修复(excisionrepair)。（三）切除修复：暗修复37（四）双链断裂修复一般只是简单地通过非同源末端连接过程将两个断裂末端拼接。38（五）复制后修复带缺口的单链可以通过重组机制从完整双链获得修复所需要的序列信息，其主要步骤如图所示。重组修复39◆SOS修复(SOSrepair)，SOS反应是DNA受到损伤或脱氧核糖核酸的复制受阻时的一种诱导反应诱导反应。在E.coli

细胞的DNA合成过程中，这种反应由recA-lexA系统调控。SOS反应发生时，可造成损伤修复功能的增强。如uvrA、uvrB、uvrC、uvrD、ssb、recA、recN和ruv基因发达从而增强切除修复、复制后修复和链断裂修复。（六）SOS反应倾向差错修复40自发突变（spontaneousmutation）第六节基因突变的诱发诱变剂41一、物理诱变物理诱变剂：(一)电离辐射诱变◆1.种类：★粒子辐射：α射线、β射线(32P、35S)、中子(60钴、137铯)；★电磁波辐射：X射线、γ射线。◆2.方法：★外照射：中子、X射线、γ射线；★内照射：α射线、β射线。423.原理：基因的化学物质(DNA)发生电离作用◆原发电离：次级电离：离子对次级电离的结果，轻则造成基因分子结构的改组，产生突变了的新基因，重则造成染色体的断裂，引起染色体结构的畸变43◆辐射剂量的表示方法：★

X射线、γ射线：伦琴(R)；★中子：积分流量(n/cm2)；★

β射线：微居里(μcu/g)。◆突变率与辐射剂量：★突变率与辐射剂量成正比；★突变率与剂量率(辐射强度)的影响无关。4.电离辐射诱变的作用规律44(二)非电离辐射诱变◆物理诱变的非特异性：对DNA分子及其核苷酸残基无选择性，所以没有专化性和特异性可言。◆

H2O2◆紫外线的作用机制：◆激发作用

原子外围的电子活跃起来紫外线(UV)特别作用于嘧啶，胸腺嘧啶联合成二聚体；胞嘧啶脱氨成尿嘧啶水加到嘧啶的C4、C5位置上成为光产物。它可以削弱C—G之间的氢键，45参观中国科学院原子

46日本原子能所47二、化学诱变诱变剂及其种类：◆碱基类似物：◆碱基修饰物：◆DNA插入剂：48(一)碱基类似物◆5–溴尿嘧啶(5BU)，5—溴去氧尿核苷、2—氨基嘌呤等在DNA复制时引起碱基配对上的差错☆转换(transition)：☆颠换(transversion：4950◆5–溴尿嘧啶类似胸腺嘧啶5–BUk—-正常的酮式状态和腺嘌呤配对(A)。烯醇式结构具有胞嘧啶的氢键特性，容易和鸟嘌呤（G）配对。5–溴尿嘧啶51(二)碱基修饰物直接改变DNA某些特定的结构

◆DNA诱变剂亚硝酸、烷化剂和羟胺等。◆亚硝酸氧代替腺膘玲和胞嘧啶C6位置上的氨基，使腺嘌呤（A）变成次黄嘌呤(H)、胞嘧啶（C）变成尿嘧啶（U）复制时完成AT→GC，GC→AT的转换。52◆烷化剂甲基磺酸乙酯(EMS)，甲基磺酸甲酯(MMS)、亚硝酸胍等。◆烷基能够移到其它电子密度较高的分子中去，从而改变氢键的结合能力。★烷化作用最容易发生在G的N7位置上，形成7–烷基鸟嘌呤。7–烷基鸟嘌呤可与胸腺嘧啶配对，使GC→AT转换6-Cl53★烷化作用使DNA的碱基容易受到水解而从DNA链上裂解下来，造成碱基的缺失★烷化剂的另一个作用是与磷酸结成不稳定的磷酸酯，磷酸酯水解成磷酸和脱氧核糖，使DNA链断裂，从而引起突变54(三)碱基插入物：引起DNA复制的错误

某些诱变剂，例如，2氨基吖啶、ICR–170等能嵌入DNA双链中心的碱基之间，引起单一核替酸的缺失或插入。

吖啶555657玉米转座子解离因子（Ds）——染色体的断裂控制因子（Ac）——可以转座，控制Ds因子转座◆Ds从原来的位点转移到C基因座位。Ds插入C座位后引起：第一染色体在C位点发生断裂；第二C–c的基因突变。这种突变在Ac因子不存在时是稳定的，种子糊粉层无色，植株也不产生色素；但在Ac存在时，有些细胞可以发生由c–C的回复突变，所以种子糊粉层和植株都会出现有色斑点玉米中的Ac、Ds及其遗传特点。58(二)真核生物的转座因子

◆

Ac因子：4563bp，带有两个与转座有关的基因，这两个酶基因从一个连接它们的共同起点开始，分别向两个方向进行转录。在两个基因未端还有两个不编码的序列，最后是由11个核苷酸组成的反向重复区。它通过由8个核苷酸组成的靶子位点重复DNA与受体基因连接起来。◆

Ds因子大小差别很大。Ds9很象Ac，只是缺失3194个核苷酸。而一个最小的Ds因子只有Ac长度的1/10，仅仅包括了Ac因子的未端反向重复区(图10－17)59（二）转座因子的结构特性(一)原核生物的转座因子

1．插入因子

◆插入因子(insertionsequence，IS)是已知具有转座能力最简单的遗传因子，长度大都小于2kb，最少的如IS1只用768bp。◆它们的一个共同特征是，在它们的末端都具有一段反向的重复序列(IR)。但其长度并不一定相等。例如IS10左边IR序列是17bp，右边是22bp。60◆是由几个基因组成的特定的DNA片段，而且往往带有抗菌素抗性基因，所以易于鉴定。根据结构特性的不同，分为：★复合转座子：由2个同样的IS因子连接抗菌素抗性片段的两侧构成的。★

Tnp3系转座子：长度约为5000bp。末端有一对3