分子生物学常用技术杂交

分子生物学常用技术凝胶电泳

分子杂交技术PCR技术DNA物理图谱

DNA序列测定生物芯片“基因靶向”技术RNA干扰技术分子杂交技术核酸分子杂交

是在DNA变性和复性的基础上建立起来的一种分子生物学技术.其原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下根据碱基互补的原则可以形成双链(碱基对之间非共价健形成稳定的双链).杂交（hydridization）指两个以上的分子因具有相近的化学性质(或结构互补)而在适宜的条件下特异地相互识别、结合形成杂交体（hybrid）的过程。（一）DNA变性DNA变性是指双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成单链无规则线团样DNA，称为DNA变性。变性方法：1):加热、2):DNA溶液的pH改变、3):有机溶剂等变性的DNA的特征：粘度下降、沉降速度增加、

浮力上升、紫外吸收增加。（二）DNA复性变性DNA只要消除变性条件，二条互补链还可以重新结合，恢复原来的双螺旋结构，这一过程称为复性。复性后的DNA，理化性质都能得到恢复。核酸分子杂交的特点:

高度特异性高度灵敏性已成为分子生物学中最常用的基本技术.广泛应用于:基因克隆的筛选酶切图谱的制作基因序列的定量和定性分析基因突变的检测等。杂交的双方:

待测核酸序列+探针（probe）待测核酸序列:克隆的DNA片段未克隆化的基因组DNA细胞总RNA,mRNA。核酸分子杂交核酸探针：是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记而便于检测的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。基因组DNA探针

cDNA探针

寡核苷酸探针

RNA探针等

探针

1、DNA探针

DNA探针是最常用的核酸探针，指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针。现已获得DNA探针种类很多:有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针。这类探针多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。来源:

分子克隆PCR２、cDNA探针

cDNA（complementaryDNA）探针是指互补于mRNA的DNA分子，是由逆转录酶催化而产生的。该酶以RNA为模板，根据碱基配对原则，按照RNA的核苷酸顺序合成DNA（其中U与A配对）。

无内含子和非编码序列

cDNA探针是目前应用最为广泛理想的一种探针。来源:

分子克隆RT-PCRDNA探针（包括cDNA探针）的优点：

①:这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖、大量制备、方法简便。

②:不易降解（相对RNA而言），DNA酶活性一般能有效抑制。

③:DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移，随机引物法等，能用于同位素和非同位素标记。3、RNA探针：

RNA探针是一类很有前途的核酸探针，由于RNA是单链分子，所以它与靶序列的杂交反应效率极高,特异性强。

克隆载体体外转录(invitrotranscription)RNA探针容易降解4、寡核苷酸探针：

根据已知的核酸序列，采用DNA合成仪合成一定长度的寡核苷酸片段，亦可作为探针使用。若不知核酸序列，可根据蛋白质的氨基酸顺序推倒出核酸顺序，但要考虑到密码子的兼并性。多用于克隆筛选和点突变分析。

人工合成的寡核酸探针有下述优点：

①短的探针比长探针杂交速度快、穿透力强。

②可以在短时间内大量制备。

③在合成中进行标记制成探针。

④可合成单链探针，避免了用双链DNA探针在杂交中自我复性，提高杂交效率。

⑤寡核苷酸探针可以检测小DNA片段，在严格的杂交条件下，可用于检测在序列中单碱基对的错配。人工合成的寡核酸探针有下述优点：①短的探针比长探针杂交速度快、穿透力强。

②可以在短时间内大量制备。

③在合成中进行标记制成探针。

④可合成单链探针，避免了用双链DNA探针在杂交中自我复性，提高杂交效率。

⑤寡核苷酸探针可以检测小DNA片段，在严格的杂交条件下，可用于检测在序列中单碱基对的错配。

筛选寡核苷酸针的原则：

①长18～50bp，较长探针杂交时间较长合成量低；较短探针特异性会差些。

②碱基成分：G+C含量为40%～60%，超出此范围则会增加非特异杂交。

③探针分子内不应存在互补区，否则会出现抑制探针杂交的“发夹”状结构。

④避免单一碱基的重复出现（不能多于4个），如-CCCCC-。

⑤一旦选定某一序更符合上述标准，最好将序列与核酸文库中核酸序列比较，探针序列应与含靶序列的核酸杂交，而与非靶区域的同源性不能超过70%或有连续8个或更多的碱基的同源，否则，该探针不能用。

克隆探针：

前述三种探针(DNA,cDNA,RNA)均是可克隆的，一般情况下，只要有克隆的探针，就不用寡核苷酸探针。

克隆探针的优点：

（1）:特异性强，从统计学角度而言，较长的序列复杂度高，随机碰撞互补序列的机会较短序列少；

（2）:可获得较强的杂交信号，因为克隆探针较寡核苷酸探针掺入的可检测标记基团更多。

核酸探针的标记核酸探针的制备是分子杂交技术的关键放射性同位素标记:敏感度高辐射危害

最早采用,最常用的核酸探针标记方法。

常用同位素:

32P、35S。

32P因其能量高，信号强，所以最常用。

半衰期:32P为14.3天、35S为87.1天、125I为60天、3H为12.3年核酸探针的常用酶促标记技术有：

缺口平移

DNA快速末端标记用T4多核苷酸酶标记DNA5'末端

随引物延伸

聚合酶链反应缺口平移DNA快速末端标记；3‘末端

随引物延伸非放射性标记物有下述几类：金属如Hg荧光物质如F2TC半抗原如地高辛、生物素酶类如辣根过氧化物酶（HRP）、半乳糖苷酶或碱性磷酸酶（AKP）等不同的标记物，所标记探针的方法及检测方法也各异。

固相杂交:将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，一条反应核酸链游离在溶液中，支持物有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等。

优点:1):未杂交的游离片段可容易地漂洗除去，2):膜上留下的杂交物容易检测,3):能防止靶DNA自我复性等。

常用类型有：菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、组织原位杂交和夹心杂交等。

液相杂交:参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。核糖核酸酶保护分析（RibonucleaseProtectionAssay，RPA）等核酸分子杂交方法Southern印迹杂交1975年，英国Southern创建DNA+DNA杂交:即将待测DNA酶切、电泳、转移（印）并固定在固相支持物上，用已知DNA探针进行检测的方法。用途：1):基因定性定量

2):DNA物理图谱3):基因变异重排4):基因限制性内切酶酶切片段长度多态性分析（RFLP）

5):疾病诊断探针:DNA探针Southern印迹杂交Southern杂交(Southernblotting)的主要步骤待测DNA样品的制备、酶切待测DNA样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳凝胶中DNA的变性：碱变性Southern转膜：硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法探针的制备

Southern杂交杂交结果的检测1．DNA的变性解链:数倍体积的1.5mol/L

NaCl和0.5mol/LNaOH中1小时2.中和:然后用数倍体积的1mol/LTris-HCl（pH8.0）和1.5mol/LNaCl溶液中和1小时3．转移:变性DNA在硝酸纤维素膜,尼龙膜上的固定。硝酸纤维素滤膜（孔径0.45um）用6SSC浸泡30min，DNA样品转移或加至硝酸纤维素膜上后，然后再在80℃真空干燥2horUVcrosslink。4．预杂交:预热至60℃的预杂交液（6×SSC，0.5%SDS，5×Denhardt液，100μg/ml鲑鱼精DNA）。鲑鱼精DNA需经过剪切和DNA酶消化处理，调浓度至10μg/ml，用前放100℃水溶液中煮沸变性10min，

Southern转膜变性杂交:

5．杂交:

尽可能挤净预杂交液，溶液的组成是6×SSC，0.01mol/L

EDTA，变性的标记核酸探针，5×Denhardt液，0.5%SDS，100mg/ml变性的鲑鱼精DNA。杂交反应在68℃水浴中进行，时间一般为4-20h。

6．洗膜:2×SSC和0.5%SDS溶液室温下漂洗5min,

2×SSC和0.1%SDS中,室温下洗涤15分钟(轻轻摇动),

0.1%×SSC和0.5%×SDS溶液中,68℃轻轻摇动保温2h，洗脱的温度一般应控制在Tm值12℃以下，[Tm=69.3+0.41×(G+C）%]。

7．结果显示:放射自显影法，只需将杂交膜与X光片在暗盒中暴光数小时至数天，再显影，定影即可.暴光通常在-20℃或-80℃,Phosphorimage定量转移缓冲液121204cellclonesDNAdigestedwithEcoRI12345678910m1112131415161718191:12:33:124:385:406:417:568:639:6510:67M:1kbmarker11:7412:7513:7614:7715:7816:9517:9818:10119:235AssaythecopynumberofprovirusinHT1080withSouthernblot191817161514131211M109876543211:12:33:124:385:406:417:568:639:6510:67M:1kbladder11:7412:7513:7614:7715:7816:9517:9818:10119:235121004cellclonesDNAdigestedwithEcoRI12345678910m1112131415161718191:542:963:974:2245:2316:2327:2338;235/nondigested9:23610:239M:1kbladder11:24012:24413:24514:24815:25216:28617:29018:30119:313AssaythecopynumberofprovirusinHT1080withSouthernblot191817161514131211M109876543211:542:963:974:2245:2316:2327:2338;235/undigested9:23610:239M:1kbmarker11:24012:24413:24514:24815:25216:28617:29018:30119:313Northern印迹杂交（Northernblotting）这是一种将待测RNA从琼脂糖凝胶中转印并固定到膜上、然后再与已知的DNA或RNA探针杂交的方法。DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术，RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为Northern印迹杂交。Northern

印迹杂交的RNA转移与Southern印迹杂交的DNA转移方法类似，只是在进样前用甲基氢氧化银、乙二醛或甲醛使RNA变性，而不用NaOH，因为它会水解RNA的2'-羟基基团。RNA+DNA/RNA杂交用途：1):基因表达(mRNA)定性定量

2):transcripts(mRNA)splicing

探针:DNA、RNA探针Northern印迹杂交

NorthernblottingRNA甲醛凝胶电泳和吸印方法

1.试剂：10×MSE缓冲液：0.2mol/L吗啉代丙烷磺酸（MOPS），pH7.0，50mmol/L醋酸钠，1mmol/L

EDTA

pH8.0。5×载样缓冲液：50%甘油，1mmol/LEDTA，0.4%溴酚蓝。甲醛：用水配成37%浓度（12.3mol/L），应在通风柜中操作，pH高于4.0。20×SSC；去离子甲酰胺；50mmol/LNaOH(含10mmol/LNaCl)；0.1mol/LTris，pH7.5。2.电泳步骤：（1）40ml水中加0.7g琼脂糖，煮沸溶解，冷却到60℃，加7ml10×MSE缓冲液,

11.5ml甲醛，加水定容至70ml，混匀后倒入盛胶槽。（2）等胶凝固后，去掉梳子和胶布，将盛胶槽放入1×MSE缓冲液的电泳槽。（3）使RNA变性（最多20μg），RNA4.5ul,10×MSE缓冲液2ul，甲醛3.5ul，去离子甲酰胺10ul。（4）55℃加热15min，冰浴冷却。（5）加2ul5×载样缓冲液。（6）上样、同时加RNAmarker/ladder。（7）60伏电泳过夜。（8）取出凝胶，水中浸泡2次，每次5min。（9）将胶浸到50mmol/LNaOH和10mmol/LNaCl中45min，

水解高分子RNA，以增强转印。（10）将胶浸到0.1mmol/LTrisHCl(pH7.5)中45min,使胶中和。（11）20×SSC洗胶1h。（12）20×SSC中过夜转印到硝酸纤维素膜上。（13）取出硝酸纤维素膜，80℃真空烘烤2hNorthernblot与Southernblot相似转移方法与杂交程序:042506ARNAgellingforsinglecopyHT1080clonesM10802496107115206228241243M1080249610711520622824124328S18SRNAsplicing

核糖核酸酶保护分析（RibonucleaseProtectionAssay，RPA）是一种高通量，各项指标均优于传统NorthernBloting的mRNA定量检测技术。

利用32P-（放射法）或生物素（非放法）标记由多个目标基因的DNA模板体外转录出的长短不一的反义RNA探针，将含过量探针的溶液与样品总RNA杂交，经核糖核酸酶（RNase）处理后，未与探针杂交的单链RNA和过量的游离探针被降解，而目标RNA则因与探针结合形成双链而被‘保护’，则杂交双链RNA的量代表了样本中相应基因的表达量。

核糖核酸酶保护分析液相杂交

信号检测：对于放射性RPA，杂交双链进行变性聚丙酰胺凝胶电泳，用放射自显影或磷屏成像系统检测被保护的探针的信号。