第一章-酶学与酶工程

第一章酶学与酶工程

第一节酶工程概述1、酶学发展历史

新陈代谢是生命活动的基础,是生命活动最重要的特征。约公元前21世纪夏禹时代,人们就会酿酒。公元前12世纪周代已能制作饴糖和用豆类做酱。

1810年JasephGaylussac发现酵母可将糖转化为酒精。1833年Payen和Persoz从麦芽得到淀粉酶制剂(diastase),其意思是“分离”。首先发现了酶。1878年,Kuhne才给酶一个统一的名词,叫Enzyme,希腊文意思是“在酵母中”。1903年，Herlri提出了酶与底物作用的中间复合物学说。

1913年Michaelis和Mentern导出了米氏方程,酶由定性到定量,奠定了酶学发展的里程碑。

1926年美国科学家Sumner从刀豆提取出了脲酶并获得结晶,证明脲酶具有蛋白质性质。奠定了现代酶学、蛋白质化学的基础。萨姆纳,J.B.美国生物化学家1946年诺贝尔化学奖

1958年，Koshland提出了“诱导契合”理论，以解释酶的催化理论和专一性。1965年Phillips首次用X射线晶体衍射技术阐明了鸡蛋清溶菌酶的三维结构。80年代初Cech和Altman分别发现了核酶(ribozyme),开辟了酶学研究的新领域,1989年共同获得诺贝尔化学奖。

切赫T.R.Cech（1947－）奥尔特曼S.Altman(1939-)

1986年Schultz与Lerner等人研制成功抗体酶(abzyme),这一研究成果对酶学研究具有重要的理论意义和广泛的应用前景。它集生物学、免疫学、化学于一身，采用单克隆、多克隆、基因工程、蛋白质工程等高新技术，开创了催化剂研究和生产的崭新领域。Boyer和walker阐明了ATP合酶(ATPsynthase)合成与分解ATP的分子机制,于1997年获得诺贝尔化学奖。ATP合酶的结构（引自Lodish等1999）现已鉴定出4000多种酶,数百种酶已得到结晶。这些问题的提出和解决，都与酶学知识和理论的掌握有直接的关系。

2、酶工程简介

（1）酶工程的产生（2）酶工程的历史(3)酶工程研究内容

（1）酶工程的产生

生物工程学(biotechnology)也叫生物技术或生物工艺学,是20世纪70年代初在分子生物学和细胞生物学基础上发展起来的一个新兴技术领域。酶工程(enzymeengineering)是生物工程的主要内容之一。是酶学和工程学相互渗透结合、发展而成的一门新的技术科学。是酶学、微生物学的基本原理与化学工程有机结合而产生的边缘科学技术。（2）酶工程的历史1894年，日本科学家首次从米曲霉中提炼出淀粉酶，治疗消化不良，开创人类有目的地生产和应用酶制剂的先例。1908年,德国科学家罗门等利用胰酶(胰蛋白酶、胰淀粉酶和胰脂肪酶的混合物)，用于皮革的鞣制。1917年,法国人用枯草杆菌产生的淀粉酶作纺织工业上的退浆剂。1949年,日本采用深层培养法生产α-淀粉酶获得成功,使酶制剂生产应用进入工业化阶段。1959年,葡萄糖淀粉酶催化淀粉生产葡萄糖新工艺研究成功,大大地促进了酶在工业上应用的前景。1953年，德国科学家首先将聚氨基苯乙烯树脂重氮化，然后将淀粉酶等与这种载体结合，制成了固定化淀粉酶。1971年，第一次国际酶工程学术会议在美国召开，会议的主题就是固定化酶的研制和应用。

20世纪70年代大规模开展了固定化细胞、辅酶共固定、增殖细胞固定、动植物细胞固定等研究。建立多种类型的酶反应器,酶工程蓬勃发展。近20年来，酶分子修饰技术、酶的化学合成以及酶的人工合成等方面的研究，也在积极地开展中，从而使酶工程更加显示出广阔而诱人的前景。当然酶工程的研究不是孤立的,而是与各个学科相互关联、相互渗透、相互促进的。(3)酶工程的内容

酶工程主要指酶制剂在工业上的大规模应用及其相应的研究，由以下部分组成:①

酶的生产；②

酶的分离纯化；③

酶的固定化；④

酶分子的改造和修饰⑤

酶抑制剂的研究⑥

生物反应器。化学酶工程和生物酶工程

化学酶工程指自然酶、化学修饰酶、固定化酶及化学人工酶的研究和应用

生物酶工程是酶学和以基因重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物,主要包括3个方面:①

用基因工程技术大量生产酶(克隆酶)②

修饰酶基因产生遗传修饰酶(突变酶)③设计新的酶基因合成自然界没有的新酶

全世界著名的酶制剂企业有：丹麦Novozymes公司、美国杰能科国际公司（Genencor)。

我国酶制剂工业诞生于1965年。现有100多家生产厂，最大的是无锡酶制剂厂。万吨以上企业有10家。品种有20多种，应用在食品、饲料、制革、洗涤剂、纺织、酿造、造纸、医药等许多行业。

使用的酶制剂类型:一类是水解酶类淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶、果胶酶、乳糖酶等,占有市场销售额的75%以上。约有60%以上的酶制剂已用基因改良菌株生产,ＮＯＶＯ公司使用的菌种有80%是基因重组菌株。

二类是非水解酶主要是分析试剂用酶、医药工业用酶、淀粉加工用酶、乳制品工业用酶第二节酶的分类、组成、结构特点和作用机制

一、酶的分类（一）酶的命名法1、习惯命名法(1)依据底物来命名（绝大多数酶）：蛋白酶、淀粉酶；(2)依据催化反应的性质命名：水解酶、转氨酶；(3)结合底物和催化反应的性质命名：琥珀酸脱氢酶；(4)有时加上酶的来源：胃蛋白酶、牛胰凝乳蛋白酶。（二）国际系统命名基本原则：明确标明酶的底物及催化反应的性质（底物为水时可略去不写）。举例：

谷丙转氨酶的系统名称：丙氨酸:

-酮戊二酸氨基转移酶

丙氨酸：α-酮戊二酸氨基转移酶（三）国际系统分类法及编号（EC编号）（1）按反应性质分六大类，用1、2、3、4、5、6表示：氧、转、水、裂、异、合；1：氧化还原酶2：转移酶3：水解酶

4：裂合酶5：异构酶6：合成酶(连接酶)（2）根据底物中被作用的基团或键的特点，将每一大类分为若干个亚类，编号用1、2、3等；（3）每个亚类又可分为若干个亚一亚类，用编号1、2、3表示。乙醇脱氢酶EC，第一个数字表示大类：氧化还原酶类第二个数字表示反应基团：醇基第三个数字表示电子受体：NAD+第四个数字表示此酶底物：乙醇。前面三个编号表明这个酶的特性：反应性质、底物性质（键的类型）及电子或基团的受体，第四个编号用于区分不同的底物。

酶的编号由4个数字组成，中间以“·”隔开。第一个数字表示大类，第二个数字表示亚类，第三个表示亚-亚类，第四个数字表示在亚-亚类中的编号。二、酶的组成和结构特点

（一）酶的化学本质

酶除了少数有催化活性的RNA分子外,几乎所有的酶都是蛋白质。具有蛋白质的典型性质。同时具有自身的特性。

（二）

酶的化学组成单纯酶类(simpleenzyme)：仅由蛋白质组成，不含其它物质，如脲酶、溶菌酶、淀粉酶、脂肪酶、核糖核酸酶等。缀合酶类（conjugatedenzyme)：全酶=脱辅酶+辅因子，二者存在酶才有催化作用；如超氧化物歧化酶（Cu2＋、Zn2＋）、乳酸脱氢酶（NAD+）

辅酶：与酶蛋白结合较松，可透析除去。如NAD+

，NADP+

辅基：共价键，与酶蛋白结合较紧，透析不可除去。如细胞色素氧化酶的铁卟啉金属离子：Fe2+、

Zn2+、Cu+、Cu2+、Mn3+、Mg2+

、K+、Na+

、Co2+等。有机化合物：NAD+

，NADP+

，FAD，生物素，卟啉等酶的辅因子主要有金属离子和有机化合物，并且根据与脱辅酶结合的松紧程度不同可分为两类，即辅酶和辅基。（一）

单体酶（二）

寡聚酶（三）

多酶复合体根据酶蛋白分子特点1.

单体酶一般是由一条肽链组成，大多是催化水解反应的酶。

牛胰RNase124a.a单链鸡卵清溶菌酶129a.a单链

2.寡聚酶由两个或两个以上亚基组成的酶，亚基可以相同或不同，一般是偶数，亚基间以非共价键结合。亚基一般无活性,必须相互结合才有活性。如乳酸脱氢酶等。3.多酶复合体由几个酶靠非共价键结合而成，其中每一个酶催化一个反应，所有反应依次进行，构成一个代谢途径或代谢途径的一部分。大肠杆菌丙酮酸脱氢酶复合体由三种酶组成：①丙酮酸脱氢酶（E1）②二氢硫辛酸转乙酰基酶（E2）③二氢硫辛酸脱氢酶（E3）（二）酶的结构特点1.有四级空间结构形式，寡聚酶必须具有正确的四级结构才有活性。2、具有活性的酶都是球蛋白,即被广泛折叠、结构紧密的多肽链,其氨基酸亲水基团在外表,而疏水基团向内。三、酶的作用机制

（一）结合部位Bindingsite酶分子中与底物结合的部位或区域一般称为结合部位。（二）催化部位catalyticsite

酶分子中促使底物发生化学变化的部位称为催化部位。酶的活性中心的概念通常将酶的结合部位和催化部位总称为酶的活性部位或活性中心。结合部位决定酶的专一性，催化部位决定酶所催化反应的性质。酶的活性中心包括底物结合部位（决定酶的专一性）、催化部位（直接参与催化反应，形成产物）酶的作用机制

酶结合底物分子,形成酶-底物复合物。酶活性部位的活性残基与底物分子结合,转变为过渡态,然后生成产物,释放到溶液中。游离的酶与另一分子底物结合后,开始它的又一次循环。（一）两种模型

1、锁和钥匙模型(lock-and-keymodel)1894年EmilFischer

德国科学家。他发现了苯肼，对糖类、嘌呤类有机化合物的研究取得了突出的成就，因而荣获1902年的诺贝尔化学奖。

认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对应一把锁一样。2、诱导契合模型(induced-fitmodel)1958年由Koshland提出。

认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状。随后的X衍射分析实验结果支持这一假说,比较满意地说明了酶的专一性。(1)

酶有其原来的形状,不一定一开始就是底物的模板。(2)

底物能诱导酶蛋白分子形状发生一定的变化。(3)

酶分子发生变化后就能与底物互补楔合。(4)

在酶反应过程中,活性中心构象的变化是可逆的诱导契合学说认为:

酶的活性部位在结构上是柔性的而非刚性的也就是说不固定的,即具可逆性和弹性。（二）酶的作用机制1、

酸碱催化酶分子的一些功能基团起瞬时质子供体或质子受体的作用。分为狭义的酸碱催化和广义的酸碱催化。狭义的酸碱催化剂即是H+与OH-广义的酸碱是指能供给质子(H+)与接受质子的物质。可作为广义酸碱的功能基团：氨基、羧基、巯基、酚羟基、咪唑基。影响酸碱催化反应速度的两个因素：⑴酸或碱的强度。组氨酸咪唑基的解离常数为6，在pH6附近（中性溶液）有一半以质子供体（酸）形式存在，另一半以质子受体（碱）形式存在。⑵给出质子或结合质子的速度。其中，咪唑基给出质子和结合质子的速度十分迅速，是酶的催化反应中最有效、最活泼的一个功能基团。2、共价催化酶的某些亲核基团，能迅速与底物形成共价中间复合物，降低反应的活化能，使反应加速。酶亲核基团：Ser-OH，Cys-SH，His-咪唑基等底物亲电中心：磷酰基（-P=O），酰基（-C=O），糖基（Glc-C-）3、邻近效应及定向效应

邻近效应

底物的反应基团与酶的催化基团越靠近,其反应速度越快。定向效应

催化基团与底物的反应基团之间的正确取位，从而提高酶催化反应速度的效应。4、变形或张力

当特异底物与酶结合时,酶蛋白发生一定构象变化,与底物发生诱导契合。酶使底物分子中的敏感键发生变形或张力。底物形变，利于形成ES复合物。进一步转换成过渡态结构，大大降低活化能。5、酶的活性中心为疏水区域

酶的活性中心常为酶分子的凹穴。此处常为非极性或疏水性的氨基酸残基。介电常数低,并排出极性高的水分子。这使得底物分子的反应键和酶的催化基团之间易发生反应,有助于加速酶催化反应。6、多元催化和协同效应

多个基元催化反应配合在一起共同起作用。

上面介绍了实现酶反应高效率的几个因素,但是并不能指出那一种因素可以影响所有酶的全部催化活性。更可能的情况是：不同的酶,起主要影响的因素可能是不同的,各自都有其特点,可以受一种或几种因素的影响。第三节酶作为催化剂的显著特点

酶与化学催化剂比较具有显著的特性。最重要的有三方面:一、高催化效率二、强专一性三、酶活性可以调控

一、高催化效率

催化能力，酶加快反应速度可高达108-1020倍。

酶促反应速度相当高,而酶催化的最适条件几乎都为温和的温度和非极端pH。以NH3为例：固氮酶：25℃、中性pH。工业：700~900K、10~90MPa（一）酶专一性类型1、结构专一性（1）绝对专一性酶对底物的要求非常严格，只能对某一种底物的某一种反应起催化作用。

脲酶只能催化尿素水解,而对尿素的各种衍生物或尿素的其它反应不起作用。（2）相对专一性：对底物专一性降低，可作用一类结构相近的底物。

二、酶的专一性★基团专一性除了对键有要求，还对于键的一端的基团要求严格。例如：α-D-葡萄糖苷酶不但要求α-糖苷键,并且要求α-糖苷键的一端必须有葡萄糖残基,而对键的另一端R基团则要求不严,因此它可催化含有α-葡萄糖苷的蔗糖或麦芽糖水解,但不能使含有β-葡萄糖苷的纤维二糖水解。★键专一性：作用于一定的键,但对键两端的基团并无严格要求。这类酶对底物结构的要求低。酯酶催化酯键的水解,而对底物R-C中的R及R’基团都没有严格的要求,即能催化水解甘油酯类、简单脂类,也能催化丙酰、乙酰胆碱等。

2.立体异构专一性

有些酶不仅对底物化学结构有要求,而且对底物分子的立体构型也有要求,称作立体异构专一性。立体异构专一性又分两类:(1)旋光异构专一性当底物具有旋光性时,酶只能作用于其中的一种。它是酶反应中相当普遍的现象。例如：

L-氨基酸氧化酶只能催化L-氨基酸氧化,而对D-氨基酸无作用。(2)几何（顺反）异构专一性

酶对底物的几何构型有严格的要求称之为几何异构专一性。

例如：延胡索酸酶只能催化反丁烯二酸（即延胡索酸），而不能催化顺丁烯二酸的水合作用。三、调节性

酶活性的调节控制主要有下列7种方式1.酶浓度的调节两种方式：诱导或抑制酶的合成；调节酶的降解

例如：β-半乳糖苷酶的合成。2.激素调节

例：乳糖合成酶

乳糖合成酶由催化亚基和调节亚基组成，可以催化乳糖合成反应：

EUDP-半乳糖+葡萄糖乳糖+UDP调节亚基合成是受激素控制的。3.共价修饰调节

在一种酶分子上,共价地引入或去掉一个基团从而改变酶的活性例：磷酸化酶的磷酸化和去磷酸化

4.限制性蛋白水解作用与酶活力调控高特异性的共价修饰调节系统例：酶原激活、血液凝固、补体激活5.抑制剂的调节例：胰脏的胰蛋白酶抑肽酶,磷酸变位酶2,3-二磷酸甘油酸6.反馈调节许多小分子物质的合成是由一连串的反应组成的。催化此物质生成的第一步反应的酶,往往可以被它的终端产物所抑制,这种对自我合成的抑制叫反馈抑制。例：异亮氨酸抑制第一个酶一苏氨酸脱氨酶7.金属离子和其他小分子化合物的调节

第四节

影响酶活性的因素

一、酶速度

酶催化反应的速率通常称作酶速度(velocity)。酶速度通常以酶促反应的初速度为准(底物消耗≤5%）。因为底物浓度降低、酶部分失活、产物抑制和逆反应等因素，会使反应速度随反应时间的延长而下降。几个概念酶的活力单位：表示酶活力大小所用的两个国际单位1IU：在最适反应条件下，每分钟催化1μmol底物转化为产物所需的酶量，称一个IU。1Kat：在最适反应条件下，每秒钟催化1mol底物转化为产物所需的酶量，称Kat单位

1Kat＝60×106IU；1IU＝1/60μKat＝16.7nKat最适条件：最适温度（25℃或37℃）,最适pH、最适缓冲液离子强度、最适底物浓度。底物浓度要求：（1）通常很大，使酶饱和；（2）底物消耗≤5%。酶活力(或总活力):样品中酶的总单位比活力:是每毫克蛋白质中酶单位的数量(U/mg)。

比活力=活力U/mg蛋白=总活力U/总蛋白mg

影响酶活力的因素1、底物浓度酶速度对底物浓度([S])的依赖关系的正常模式是：在低的底物浓度下,[S]增加1倍,将导致起始速度(Vo)也增加1倍。在较高底物浓度下,酶被饱和,进一步增高[S],只导致Vo的微小变化。进一步加入底物对酶速度也将不发生影响。Vo对[S]的关系图形称为双曲线(hyperboliccurve)2、酶浓度在底物浓度饱和的情况下(即所有酶分子都与底物结合),酶浓度的加倍将导致Vo的加倍。Vo与酶浓度的关系图为直线图形。

3、温度的影响一方面是温度升高,酶促反应速度加快。另一方面,温度升高,导致酶活性降低甚至丧失。大多数酶都有一个最适温度。在最适温度条件下,反应速度最大。最适温度不是酶的特征物理常数,也不是固定值,而与酶作用时间的长短有关。生物不同生长阶段有不同的最适温度。4、pH

每个酶都有最适pH,在此pH下催化反应的速率是它的最高值。（1）最适pH有时因底物种类、浓度及缓冲液成分不同而不同。（2）酶的最适pH并不是一个常数,只是在一定条件下才有意义。pH影响酶活力的原因可能有以下几个方面:(A)过酸,过碱会影响酶蛋白的构象,甚至使酶失活。(B)

影响底物分子的解离。(C)pH影响酶分子的解离,而这些基团的离子化状态与酶的专一性及酶分子中心活力中心的构象有关。第五节酶动力学和抑制作用一、米-曼氏模式

1、Michaelis-Menten方程的建立

米氏方程

2、米氏常数的意义

Km：米氏常数，物理意义为反应速率为最大速率Vmax一半时底物的浓度，单位与底物浓度同（1）Km是酶的一个特性常数，Km大小只与酶性质有关，而与酶浓度无关。当底物确定，反应温度，pH及离子强度一定时，Km值为常数，可用来鉴别酶。

Km一般在1×10-6~10-1mol/L之间不同的酶Km值不同，测定Km要在相同测定条件（pH、温度、离子强度）下进行。（2）Km值可用于判断酶的专一性和天然产物，若一个酶有几种底物就有几个Km值，其中Km值最小的底物称为该酶的最适底物，又称天然底物。（3）可近似表示酶与底物亲和力的大小。真正表示酶与底物亲和力为Ks=k2/k1

(注Km=k2+k3/k1)（4）已知Km可由[S]计算v，或由v计算[S]。

二、Lineweaver-Burk作图y=ax+b纵轴截距：1/Vmax；横轴截距：-1/Km；斜率：Km/Vmax。其他三种作图法0[S]Hanes-Woolf

作图法Eadie-Hofstee作图法

（v对v/[S]作图法）Vmax对Km作图法表2－1四种作图法特征比较作图方式斜率纵轴截距横轴截距1/v～1/[S]Km/Vmax1/Vmax-1/Km[S]/v～[S]1/VmaxKm/Vmax-Kmv～v/[S]-KmVmaxVmax/KmVmax～Kmv/[S]v[S]三、酶的抑制作用

抑制作用：酶的必需基团的化学性质改变而引起酶活力降低或丧失，但不引起酶蛋白变性。凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质称为酶的抑制剂。意义：研究酶的抑制剂，可以研究酶的结构与功能、酶催化机制，进行药物、农药的设计与筛选。（一）抑制作用的类型：

1.

不可逆抑制作用Irreversibleinhibition2.

可逆性抑制作用Reversibleinhibition

1)

竞争性抑制

Competitiveinhibition2)非竞争性抑制

Non-competitiveinhibition

3)反竞争性抑制Uncompetitiveinhibition

非专一性不可逆抑制剂不可逆抑制剂专一性不可逆抑制剂有机磷化合物、有机汞有机砷化合物、重金属盐、烷化试剂氰化物、硫化物和CO、青霉素Ks型抑制剂Kcat型抑制剂1、不可逆抑制作用

这类抑制剂通常以共价键与酶蛋白中的基团结合，从而使酶活性降低，甚至丧失。不能用透析、超滤等物理方法除去这些抑制剂，使酶活性恢复。非专一性不可逆抑制剂

概念：抑制剂作用于酶的一类或几类基团，这些基团中包含了酶的必需基团，从而引起酶失活。类型：

①有机磷化合物②有机汞、有机砷化合物③重金属盐④烷化试剂⑤氰化物、硫化物和CO⑥青霉素有机磷化合物

很多农药是有机磷化合物，它们能抑制某些蛋白酶及酯酶的活力，与酶分子活性部位的丝氨酸羟基共价结合而使酶失活。这类化合物强烈地抑制胆碱酯酶活力，使乙酰胆碱不能水解成乙酸和胆碱，导致乙酰胆碱积累，引起神经中毒症状。所以这类化合物又称为神经毒剂。用解磷定（碘化醛肟甲基吡啶）或氯磷定（氯化醛肟甲基吡啶）能把酶上的毒剂夺取下来，使酶恢复活力，达到解毒的作用。

有机磷化合物解磷定的解毒机理有机汞化合物

有机汞化合物能与酶的巯基结合而使酶失活。过量的半胱氨酸或还原型谷胱甘肽能解毒。

有机砷化合物

有机砷化合物能与酶的巯基结合而使酶失活。BAL（二巯基丙醇）能解毒。

路易斯毒气重金属盐

Ag+、Cu2+、Hg2+、Pb2+、Fe3+在高浓度时能使酶蛋白变性，低浓度时抑制某些酶的活力。可用金属螯合剂EDTA、半胱氨酸等螯合除去重金属离子。

烷化试剂含有一个活泼的卤素离子，能够修饰酶分子中的许多基团，如巯基、氨基、羧基、咪唑基及硫醚基等。烷化试剂氰化物、硫化物和CO

氰化物能与细胞色素氧化酶中的Fe2+结合，使酶失活不能呼吸。CO与血红蛋白结合阻止氧运输。硫化物能与多种含金属的酶形成较为稳定的络合物，使酶失活。

糖肽转肽酶在细菌细胞壁合成中使肽聚糖链交联。青霉素与糖肽转肽酶的丝氨酸羟基结合，使细菌细胞壁不能合成。

青霉素

青霉素的抗菌机理Ks型抑制剂Kcat型抑制剂专一性不可逆抑制剂

Ks型不可逆抑制剂

此类抑制剂是根据底物的化学结构设计的，具有一个与底物相似的可以与酶结合的基团，可直接结合于酶的活性部位，同时还带有一个活泼的化学基团，能与酶分子中的必需基团反应进行化学修饰，从而抑制酶活性。因抑制是通过对酶的亲和力来对酶进行修饰标记的，故称为亲和标记试剂。例：胰蛋白酶的Ks型不可逆抑制剂2-甲苯磺酰-L-赖氨酰氯甲烷（TPLK）

例：胰蛋白酶的Ks型不可逆抑制剂（TPLK）胰蛋白酶的人工底物胰蛋白酶的Ks型抑制剂Kcat型不可逆抑制剂特点

该类抑制剂是根据酶的催化过程设计的。它不但具有天然底物类似的结构，且本身也是酶的底物，能与酶结合发生类似于底物的变化，但其分子中还有一个潜伏的反应基团。当酶对它进行催化反应时，这个潜伏反应基团被暴露或活化，并立即与酶活性中心某基团或酶的辅基呈不可逆结合，使酶不可逆失活。此类抑制剂是专一性极高的不可逆抑制剂，亦称酶的自杀性底物（suisidesubstrate）。例：迫降灵以FMN或FAD为辅酶的单胺氧化酶的抑制作用。例：以FMN或FAD为辅酶的单胺氧化酶的Kcat型不可逆抑制剂迫降灵加成反应迫降灵是一种单胺氧化酶的自杀性底物，是治疗高血压的良药。由于迫降灵能抑制单胺氧化酶，也就能抑制一些血管舒张剂（如组胺）的氧化，因而有降血压的作用。2.

可逆性抑制作用

抑制剂通常以非共价键与酶可逆性结合，使酶的活性降低或丧失；抑制剂可用透析、超滤等方法除去。类型

竞争性抑制非竞争性抑制

１）竞争性抑制作用+IEIE+SE+PES反应模式定义抑制剂与底物的结构相似，能与底物竞争酶的活性中心，从而阻碍酶底物复合物的形成，使酶的活性降低。这种抑制作用称为竞争性抑制作用。

*特点充分的高底物浓度可以将结合到活性部位的抑制剂分子竞争地排出，因此酶的Vmax不变，但在竞争性抑制剂存在下，酶对其底物的亲和力降低，因此Km增大。I与S结构类似，竞争酶的活性中心；竟争性抑制

某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竟争与酶活性中心结合。当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制了。

竟争性抑制通常可以通过增大底物浓度，即提高底物的竞争能力来消除。S竞争性可逆抑制图示I例:丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制作用

②竞争性抑制作用动力学方程的讨论

A、与标准米氏方程比较B、当[I]→0时，方程还原成米氏方程。

[I]→∞时，交于y轴C、取方程的倒数，进行双倒数作图

2)非竞争性抑制底物和抑制剂同时和酶结合,两者没有竞争作用。

酶活力降低

如Leu是精氨酸酶非竞争性抑制剂。

非竞争性可逆抑制作用（noncompetitivereversibleinhibition）

E+S→ESESIE+I→EIESI特点抑制剂与酶活性中心外的必需基团结合，底物与抑制剂之间无竞争关系；抑制程度取决于抑制剂的浓度；非竞争性抑制剂的效应不能由增高底物浓度而克服，所以Vmax降低，酶对底物的亲和力不变，因此Km不变。

非竞争性抑制酶可同时与底物及抑制剂结合，即底物和抑制剂没有竞争作用。酶与抑制剂结合后，还可与底物结合；酶与底物结合后，也可再结合抑制剂，但是三元的中间产物不能进一步分解为产物，所以酶活性降低。

非竞争性抑制剂与酶活性中心以外的基团结合。这类抑制作用不会因提高底物浓度而减弱非竞争性可逆抑制图示非竞争②非竞争性抑制作用动力学方程讨论A、与米氏方程比较B、当[I]→0[I]→∞C、取方程倒数，进行双倒数作图3)反竞争性抑制作用反竞争性抑制的反应式反竞争性抑制的双倒数作图法反竞争性抑制剂存在时，Vmax

降低，Km

亦降低。各种可逆性抑制作用的比较

结合部位

KmVmax无竞争剂

KmVmax竞争性抑制

E 增大不变

非竞争性抑制

E,ES 不变 减小反竞争性抑制

ES 减小 减小

可逆抑制作用和不可逆抑制作用的鉴别1.物理方法用透析、超滤和凝胶过滤等方法是否能除去抑制剂来鉴别可逆抑制作用和不可逆抑制作用。2.动力学方法在测定酶活力系统中加入一定量的抑制剂，测定酶反应的初速度，以初速度和酶浓度作图。3酶抑制剂的应用保健药物

美容药物

农用药物

医药领域的应用二氢叶酸合成酶对氨基苯甲酸二氢叶酸四氢叶酸二氢叶酸合成酶二氢叶酸还原酶转肽酶痛风病药物作用机理药物被抑制的酶治疗机理概要磺胺二氢叶酸合成酶抗菌。苯甲酸类似物；核酸合成障碍。氨基蝶呤，氨甲蝶呤二氢叶酸还原酶抗白血病。FH4合成障碍；核酸合成障碍。青霉素，β-氟代-D-丙氨酸细菌转肽酶抗菌。酶的自杀底物；胞壁合成障碍。5-氟尿嘧啶(尿嘧啶类似物）尿苷磷酸化酶抗癌。酶的自杀底物；肿瘤细胞不能合成核酸。5-氟脱氧尿苷酸胸苷酸合成酶抗癌。酶的自杀底物；肿瘤细胞不能合成DNA。一些药物对酶的抑制效应药物被抑制的酶治疗机理概要别嘌呤醇黄嘌呤氧化酶抗痛风。酶的自杀底物；抑制尿酸生成。优降宁线粒体单胺氧化酶降血压。降低去甲肾上腺素在血管上积累。开搏通(巯基甲脯氨酸)血管紧张素转化酶降血压。自杀性底物；抑制血管紧张素Ⅱ的生成。阿卡波糖α-葡萄糖苷酶治疗糖尿病。酶的竞争性抑制剂；降低血糖。一些药物对酶的抑制效应酪氨酸酶（微生物产黑色素的关键酶）L-多巴（DOPA）黑色素酪氨酸酶抑制剂（曲酸）酪氨酸肉毒素的小分子抑制剂肉毒素是由两个肽链构成的，一个重链和一个轻链。重链靶向并结合到神经末梢的表面受体。这样肉毒素就可进入神经末梢内部。一旦进入，轻链就与重链分离，切断控制神经肌肉功能的特异蛋白。这些蛋白的破坏有效阻止了引起肌肉收缩的神经递质的释放，而肌肉收缩是呼吸所必需的。肉毒素侵入神经末梢的结果就是导致瘫痪，最终导致窒息和死亡。农业领域

胆碱酯酶:胆碱酯酶催化胆碱酯生成乙酰胆碱（神经系统受体），缺乏受体造成昆虫神经系统紊乱，痉挛而死。

第六节蛋白质、酶和重组蛋白质的分离纯化一、蛋白质纯化的一般考虑

根据酶的使用目的确定纯化策略制备方法的经济性。分离纯化用的原料来源要方便,成本要低;效率高，步骤简单。（一般纯化步骤不超过5步）条件要尽可能十分温和，防止酶变性失活。

建立灵敏、特异、精确的检测手段,评估纯化方法

二、防止酶变性失活的方法尽可能在低温下进行分离纯化，尤其是有机溶剂存在时。尽量避免局部过酸过碱。防止泡沫的形成。加入巯基试剂（如巯基乙醇，二硫苏糖醇等），避免酶被氧化。加入蛋白酶抑制剂，防止内源性蛋白酶的降解。（一）材料的选择天然材料：早期酶制剂多是从动植物中提取。但动植物原料生长周期长、成本高，又受地理、气候和季节等因素影响。基因工程材料：对于天然不易得到的蛋白，目前通过工程菌或工程细胞表达而获得。工业用酶多采用微生物发酵生产。三、酶的分离和纯化植物、动物、微生物细胞的特性比较微生物发酵

目前工业应用酶大多数来自微生物，这是因为以微生物为生产原料有许多优点。微生物种类繁多；产酶微生物多；一种微生物可以产多种酶；微生物繁殖快、生产周期短、培养方便；微生物易改造，可通过多种手段进行育种。酶的发酵生产酶的生产菌——先决条件，直接影响发酵的生产成本。对生产菌的要求：非病源菌，同时在系统发育上与病原菌无关，不产毒素及其他生理活性物质；产酶量高，最好分泌胞外酶；生产菌稳定，不易变异、退化、不易感染噬菌体；容易培养，能利用廉价原料，发酵周期短。生产菌的获得采样—分离—筛选—诱变；采样：在富含该酶作用底物的场所采样；在与酶活性最适条件相同的环境采样；富集培养：投其所好，取其所抗。分离：平板划线法、直接稀释法.筛选：初筛、复筛；向菌种中心购买或索取。中国国家级菌种保藏管理中心（7个）名称及成立年份依托单位中国农业微生物菌种保藏管理中心中国农业科学院土壤肥料研究所(ACCC)—1980中国工业微生物菌种保藏管理中心中国食品发酵工业研究院(CICC)—1979中国医学微生物菌种保藏管理中心中国药品生物制品检定所(CMCC)—1979中国兽医微生物菌种保藏管理中心中国兽医药品检定所(CVCC)—1979中国林业微生物菌种保藏管理中心中国林业科学研究院(CFCC)—1985中国抗菌素菌种保藏管理中心中国医学科学院医药生物技术研究所(CACC)—1979中国普通微生物菌种保藏管理中心中国科学院微生物研究所(CCGMC)—1979国外菌种中心AmericanTypeCultureCollection

JapanCollectionofMicroorganismshttp://www.jcm.riken.go.jpTheUnitedKingdomNationalCulturecollectionhttp://www.ukncc.co.ukDeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenhttp://www.dsmz.deATCC美国菌种中心，最大的菌种中心,有病毒、细菌、真菌、细胞等不同的微生物JCM日本微生物菌种中心英国国家菌种中心，Over70,000micro-organismsandcelllinesareavailable.德国微生物与细胞收集中心主要产酶菌大肠杆菌：应用最广泛的产酶菌，一般分泌胞内酶。因为其遗传背景清楚而广泛应用于遗传工程改造微生物的宿主，被改造成表达优良性状的“工程菌”。也常在工业生产中应用于生产谷氨酸脱羧酶、门冬氨酸酶、限制性核酸内切酶等。枯草杆菌：工业上应用最广泛的产酶菌之一，淀粉酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酯酶等的产酶菌。啤酒酵母：工业上广泛应用，主要产转化酶、醇脱氢酶、丙酮酸脱羧酶等。曲霉（黑曲霉和黄曲霉）：糖化酶、蛋白酶、果胶酶、氨基酰化酶、葡萄糖氧化酶、淀粉酶、氨基酰化酶、脂肪酶等多种酶。提高酶产量的方法条件控制：优化发酵条件，包括培养基：碳源、氮源、无机盐和生长因子、pH值、温度、溶解氧、发酵周期等；添加诱导物、降低阻遏物浓度。遗传控制：物理、化学法诱变育种；基因重组构建工程菌。提高产酶量的措施1、添加诱导物能使某些酶的生物合成开始或加速进行的物质。酶的作用底物：（诱导酶）大肠杆菌在含乳糖的培养基中能大量合成β-半乳糖苷酶酶的反应产物：纤维二糖诱导纤维素酶的生物合成。酶作用底物的类似物：异丙基-β-硫代半乳糖苷对β-半乳糖苷酶的诱导效果比乳糖高几百倍。进一步研究和开发廉价的诱导物具有重要的意义和应用前景2、控制阻遏物的浓度产物阻遏：由酶催化作用的产物或代谢途径的末端产物引起的阻遏作用。分解代谢物阻遏：有分解代谢物（如葡萄糖或其他容易利用的碳源等物质经过分解代谢而产生的物质）引起的阻遏作用。无机磷酸﹥1.0mmol/L﹤1.0mmol/L碱性磷酸酶合成受阻碱性磷酸酶大量合成控制碳源浓度、添加一定量的环腺苷酸减少解除阻遏物是能够引起某些酶的生物合成停止或者减速的物质。3、添加表面活性剂细胞膜高度的选择透性表面活性剂增加细胞的透过性利于胞外酶分泌酶产量↑4、添加产酶促进剂产酶促进剂是指可以促进产酶，但作用机理未阐明清楚的物质。同步合成型(或称生长偶联型）

酶的生物合成与细胞生长同步进行的一种酶生物合成模式。该类型酶的生物合成速度与细胞生长速度紧密联系，又称为生长偶联型。

大部分组成酶的生物合成属于同步合成型，有部分诱导酶也按照此种模式进行生物合成。所对应的mRNA很不稳定，一般其寿命只有十几分钟。

细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml总细胞浓度活细胞浓度胞外酶浓度胞内酶浓度酶生物合成的模式中期合成型：该类型的酶在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的生物合成也随之停止。细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml酶生物合成的模式例如，枯草杆菌碱性磷酸酶（Alkalinephophatase，EC)。无机磷酸反馈阻遏物细胞生长的营养物质在细胞生长的开始阶段,培养基中的磷阻遏酶的合成，当磷几乎被细胞用完以后，酶才开始大量生成。又由于该酶所对应的mRNA不稳定，其寿命只有30min左右，当细胞进入平衡期后，酶的生物合成随之停止。

该类型酶的生物合成受到产物的反馈阻遏作用或分解代谢物阻遏作用，所对应的mRNA稳定性差。延续合成型（或称部分生长偶联型）

酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成一段较长时间。

属于该类型的酶可以是组成酶，也可以是诱导酶。

所对应的mRNA相当稳定。细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml以半乳糖醛酸为诱导物以含有葡萄糖的果胶为诱导物酶生物合成的模式滞后合成型（或称非生长偶联型）

酶在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物合成并大量积累。又称为非生长偶联型。原因：受到培养基中存在的阻遏物的阻遏作用。随着细胞的生长，阻遏物几乎被细胞用完而使阻遏解除后，酶才开始大量合成。若培养基中不存在阻遏物，该酶的合成可以转为延续合成型。该类型酶所对应的mRNA稳定性很好。黑曲霉羧基蛋白酶生物合成放线菌素D对产酶的影响细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml酶浓度U/ml酶浓度U/ml30℃22℃不加加入不加加入酶生物合成的模式理想的酶合成模式mRNA的稳定性好：可以在细胞生长进入平衡期以后，继续合成其所对应的酶；差：随着细胞生长进入平衡期而停止酶的生物合成不受其阻遏：可以伴随着细胞生长而开始酶的合成；受其阻遏：在细胞生长一段时间甚至在平衡期后，酶才开始合成并大量积累。培养基中存在的某些物质理想的酶合成模式最理想的合成模式应是延续合成型因为属于延续合成型的酶，在发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞一开始生长就有酶产生，直至细胞生长进入平衡期以后，酶还可以继续合成一段较长的时间。同步合成型：提高其对应的mRNA的稳定性，适当降低发酵温度是可取的措施；滞后合成型：设法降低培养基中阻遏物的浓度，尽量减少甚至解除产物阻遏或分解代谢物阻遏作用，使酶的生物合成提早开始；中期合成型：在提高mRNA的稳定性以及解除阻遏两方面下功夫，使其生物合成的开始时间提前，并尽量延迟其生物合成停止的时间。（二）细胞破碎细胞壁的主要成分：细菌：肽聚糖：N-乙酰萄糖胺，N-乙酰胞壁酸真菌和酵母：萄聚糖，甘露聚糖藻类：纤丝状多糖类细胞破碎的方法：1）机械法2）物理法3）化学法4）生物法（酶解）