法医-法医物证学

法医物证学

Forensicgenetics一、概述

法医物证学是研究与法律有关的生物学检材的个体识别鉴定及亲子鉴定的法医学科。1.物证（materialevidence）：对案件的真实情况有证明作用的物品和痕迹叫作物证。2.生物学检材（biologicalmaterials）：涉及人体器官、组织、分泌物及排泄物等的有关物证叫作生物学检材，又称法医物证（或生物物证）。

3.物证检验：凡以侦察、审判为目的，对与案件有关的物品、痕迹进行检验鉴定，以判定物证是否能够作为肯定或否定证据的过程叫作物证检验。①个体识别

(personalidentification)②亲子鉴定

(parentagetesting)法医物证学的主要任务:二、遗传标记（一）概述

1.遗传标记（geneticmarker,GM）

指人类受遗传控制的个体特征，具有受遗传控制和终身不变两个特征。传统遗传学概念：性状（character）。遗传标记主要是指由单基因座控制的性状。遗传标记检测方法：免疫学技术检测生物化学方法分子生物学方法

遗传标记是由同一基因座上不同等位基因所控制。遗传学多态性的原因是基因座位出现等位基因。例如：ABO基因座染色体定位：9q34

等位基因（allele）有：A、B、O

基因型（genotype）有：AA、AO、BB、BO、

AB、OO

表型（phenotype）有：A、B、AB和O等4种。遗传标记的传递遵循孟德尔遗传规律：①同基因座等位基因在配子形成过程中彼此分离，分别进入各自的配子细胞（分离律）；②不同基因座等位基因在配子形成过程中，可分可合，随机组合进入同一配子细胞（自由组合律）。2.遗传学多态性（geneticpolymorphism）

●通过某类型遗传标记的检测，可以将人群分开成若干类型的现象叫作遗传学多态性。●从遗传学角度给遗传学多态性下一个定义：由2个或者2个以上等位基因控制的性状的个体差异，等位基因频率在0.01~0.99之间。3.分类

⑴

基因表达产物（蛋白）水平标记：血液各成分中的遗传标记均是基因的表达产物，具有个体差异。红细胞血型（RBCbloodtype）酶型（isoenzymetype）血清型（serumtype）

白细胞抗原（humanleukocyteantigen,HLA）

⑵

DNA分子水平标记：(二)DNA遗传标记

DNA多态性原因是在特定的基因座（locus）上，因碱基的突变（mutation）出现了等位基因（allele）；且等位基因在个体得以保留，并按照孟德尔遗传规律由亲代向子代遗传。

DNA遗传标记等位基因形式:⑴等位基因的片段长度差异；⑵等位基因的序列差异。1.DNA长度多态性(DNAlengthpolymorphisms)

人类基因组DNA长3×109bp，编码基因序列约占不到5%，非编码序列包括间隔序列，基因调控序列，基因内含子等。真核基因的内含子序列占基因序列的5%~30%。基因组DNA中大约10%是串联重复（tandemrepeats）DNA，结构形式是以一个序列相对恒定的DNA片段构成核心序列（coresequence），作为重复单位，首尾相接，串联重复。这种特殊的串联重复序列叫作：卫星DNA(satelliteDNA)。

⑴卫星DNA分类：按照核心序列的碱基结构特征，卫星DNA分为：

●

大卫星(macrosatelliteDNA)

●

小卫星(minisatelliteDNA)

●

微卫星(microsatelliteDNA)DNA长度遗传标记主要位于小卫星和微卫星DNA序列中。①大卫星：是一类核心序列具有相近的碱基构成，相近的浮力密度的卫星DNA。早年对基因组DNA等密度梯度离心研究中，在主要区带外存在若干个次要成分，序列分析证实是卫星DNA。分卫星Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和α卫星等，按照浮力密度相近的分为一类。又称经典卫星DNA（classicalsatellite)。大卫星中的序列多态性在法医学应用无多大的价值。②

小卫星和微卫星

小卫星和微卫星是依据核心序列的长度人为地分类。

小卫星重复单位：15~30bp，重复次数数次至数百次；

微卫星重复单位：2~6bp，重复次数次至数十次。小卫星和微卫星是DNA长度多态性的主要序特征性序列。⑵可变数目串联重复序列小卫星和微卫星都具有特定的基因座位，其中部分卫星DNA序列，因不同个体、不同等位基因之间，重复单位的串联重复的次数不同形成了DNA片段长度差异，称作可变数目串联重复序列（variablenumberoftandemrepeats,VNTR），VNTR序列大约占一半左右，是构成DNA片段长度多态性的主要原因。

小卫星序列都位于基因组高变区，是基因组中的重组热点。其中VNTR序列呈现极其复杂的长度多态性。例如：某小卫星VNTR座位重复单位17bp，重复次数70～450次则最短的基因长：17bp×70＝1190bp

最长的基因有：17bp×450＝7650bp

等位基因数应为：450－70＋1＝381个基因型数为：[381(380＋1)]÷2＝72771个

早期的法医DNA分型是针对小卫星靶序列，应用限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）分析，RFLP图谱具有高度个体特异性，被称为DNAfingerprint。以小卫星核心序列为探针，对人类基因组DNA作RFLP分析，显示图谱类似超市商品条码，由10~30条谱带组成，不同个体间，谱带数目不同，谱带的位置不同。人群中随机两个体的DNA指纹完全相同的几率为10-12~10-19。法医物证鉴定：①从蛋白质水平进入DNA水平②实现从否定到认定的飞跃随机10个体DNA指纹图谱探针：珠蛋白-3‘-HVR限制酶：HinfI1，2，4，5，6，7：均为随机个体。3为凶器上血痕。与现场收集的血痕的DNA指纹一致。

图中现场血痕与作案凶器上的血痕经过DNA指纹检测，有18条长度相同片段。

群体调查汉族人群，每一片段出现平均频率为0.198。按照Jeffreys提供的匹配概率（Pm值）计算方法：

Pm＝0.19818＝2.19×10-13。

微卫星：microminilliteDNA

DNA重复单位2~6bp,重复次数10~30次，又称短串联重复序列

(shorttandemrepeats，STR)

或simpletandemrepeats。其中大约有一半具有VNTR序列特征，是目前应用最普遍的一类标记系统。目前在人类基因组中发现STR座位有8000余个。（3）STR分型基本技术

PCR-STR分型技术：①参照STR重复序列的侧翼序列设计引物，PCR扩增STR片段长度等位基因。②扩增产物用聚丙烯酰胺(polyacrylamidegel，PAG)凝胶电泳分离，③不同长度等位基因按重复次数(allelicladder)参照,以重复次数命名等位基因。

▲银染技术，电泳分离后用银染显带。

D16S539，D7S820，D13S317，D5S818四STR基因座复合扩增分型图谱。

▲

荧光标记PCR引物，扩增产物携带荧光，毛细管电泳，然后利用激光激发荧光显色基团，检测仪自动记录荧光波长和迁移率(由genotyper软件)自动分型。1.不同荧光标记引物，致等位基因扩增产物携带有荧光示踪基团，按不同波长区分基因座。2.在毛细管电泳中，记录电泳加样点至检测窗口的时间，迁移时间表示片段长度。AmpFlSTR®Identifiler™等位基因分型标准参照图

3等位基因片段长度多在300bp以下，适用于腐败、降解、陈旧法医检材。

4种属特异性好，引物具有人的种属特异性，材料中混合有动物血痕，不影响人血的STR分析。

5复合扩增，提高单次检测的信息量，常规使用10-16个STR基因座，识别能力达到DNA指纹的鉴别水平。

6实现标准化、自动化的分型，加上计算机技术辅助，建立全国范围的罪犯DNA数据库成为现实。三个样本的Identifiler™基因座等位基因分型图PCR-STR分型的技术优势：

1高灵敏度，利用PCR的高灵敏度特征，理论上单个细胞的DNA可以扩增出靶DNA片段。目前法医学鉴定的灵敏度达到ng级DNA水平。

2高特异性，针对靶基因座侧翼序列设计的PCR引物，引物的特异性决定了扩增产物的特异性。2.DNA序列多态性

在基因组特定的基因座位，等位基因的碱基序列差异构成的多态性叫作序列多态性(sequencepolymorphism)。序列多态性形成的主要原因是点突变。在同基因座位上，因为碱基的替换构成不同等位基因的序列差异。可以出现在编码区，也可以出现在非编码区。人类线粒体DNA（mitochondrialDNA）

mtDNA是唯一的核外DNA，呈环状裸露的双股螺旋结构，分重链(H)和轻链(L)，长度16569bp，编码37个与氧化磷酸化相关的蛋白质和RNA。其中有5%~7%的序列为非编码区，成为控制区（controlregion），长度大约1100bp。在控制区碱基序列处于高度变异状态。大约2/3的碱基有变异，大约90%为转换，10%为颠换。（三）群体遗传学基础在法医学鉴定中，为了给法庭说明鉴定结论的意义，必须将鉴定结论进行量化。其中涉及到群体遗传的基础理论。1概念：△表型频率(phenotypefrequence)：应用分型技术对人群分型检测，不同表型在人群中所占的比例就叫作表型频率。例如A在人群中占23%，B：19%，AB：9%，O：49%。△

基因频率(genefrequence)：群体中某一等位基因占该群体中可能出现的等位基因总数的比例：

例如；维族调查1513人的MN血型：

M型689人（0.3893）；

MN型713人（0.4712）；

N型211人（0.1395）因此*M＝(2×689＋713)/(2×1513)＝0.6249*N＝(2×211＋713)/(2×1513)＝0.3751总结计算公式为：基因频率=纯合子个体数×2＋杂合子人数

2×观察总人数

注意：一个基因座所有等位基因频率的和等于1

2遗传平衡定律

(Hardy-Weinbergequilibrium)▲假设前提：①群体无限大，②婚配随机，③没有突变，④没有任何形式的选择。▲结论：该群体中各等位基因频率保持累代不变。总结上式：

(pA1+qA2)2＝p2A1A1+2pqA1A2+q2A2A2

因此，在达到遗传平衡的群体：基因频率和基因型频率间成‘二项式展开数学式’的关系：

(1)纯合子基因型频率=该基因频率的平方。

(2)杂合子基因型频率=两基因频率乘积的2倍。

例如：*M=0.6249；*N=0.3751则表型频率为：

M＝0.62492＝0.3905MN＝2×0.6249×0.3751＝0.4699N＝0.37512＝0.1407

按照H-W平衡定律的结论，可以从基因频率计算出遗传标记表型的频率，作为‘匹配概率’，以评估两份检材是否来自同一个体。

3匹配概率：当检材和样本经过分型鉴定，表型一致，称为匹配(match)。

匹配概率(matchprobability，Pm)是指需要作个体识别的两份检材，经过鉴定，基因型相同。假设‘检材’和‘样本’不是来自同一个体，因为偶然的机会相同的机会。这个概率就是该基因型在人群中的频率。例如凶器上血痕与被害人血都是A型，随机匹配概率为0.23。

累计匹配概率(CPm)：

等于各个标记的表型频率的乘积。条件是各

个遗传标记系统是独立遗传，之间没有遗传

连锁关系（乘法原则）。例如：一把匕首上血痕与被害人血经过8个STR基因座测定，结果如下：生物检材的个人识别：●血痕检验●精液斑检验●唾液斑检验●毛发检验●骨骼检验●牙齿检验●其它组织的检验一、血痕检验

血痕检验的主要内容：

是否血痕；

是人血还是动物血；

血痕遗传标记分型检测即个体识别。（一）预试验

预试验属于筛选试验，将不是血痕的斑迹筛选出来。常用灵敏度高，操作简单的试验。●联苯胺试验（Benzidinetest）原理：血痕中血红蛋白、正铁血红素具有过氧化酶活性，能是过氧化氢释放新生态氧，将无色的联苯胺氧化成联苯胺蓝。试剂：冰醋酸、联苯胺乙醇溶液、30%H2O2。操作：取少量可疑血痕置白色反应板上，1滴冰醋酸，1滴过氧化氢，1滴联苯胺液。立即出现兰色为阳性反应。注意事项：⑴高灵敏度，血液50万倍稀释，仍可出现阳性结果。⑵两类干扰物质：①含有过氧化物酶的植物，蔬菜和水果，可以出现假阳性；②氧化剂可直接将联苯胺氧化，呈兰色变化。所以试验阳性不能认为可疑斑迹是血痕。只能结论：‘可能是血痕’。⑶联苯胺试验的意义在阴性结果，阴性结果可以排除血痕。

（二）确证试验●血色原结晶试验（hemochromogencrystaltest）

原理：在碱性条件下正铁血红素分解成血红素和变性珠蛋白，正铁血红素在还原剂作用下还原成血红素，血红素与含氮物质吡啶结合生成樱桃红色针状、菊花状结晶。

试剂：NaOH，葡萄糖，吡啶.（Takayama试剂）

操作：出现樱桃红色针状、菊花状结晶为阳性。血色原结晶LessonI

TakayamaCrystalTakayamaCrystal注意事项：⑴特异性好，凡血痕检材可出现阳性结果，凡出现典型的血色原结晶的检材就是肯定是血痕。⑵灵敏度不高，血液稀释200倍就难以获得典型的血色原结晶。凡稀释、雨淋、细菌污染和腐败血痕难出现典型结晶。⑶所以血色原结晶试验的意义在阳性结果。阴性没有意义，需要继续作种属试验。（三）种属试验

种属鉴定是血痕鉴定的关键。动物学中存在血型物质，例如鸡有A型抗原物质，未确证人血即作ABO血型测定，可造成错案。自然界广泛存在与人类血型抗原类似的物质，微生物如大肠杆菌，肺炎双球菌。细菌污染的腐败血痕可能测定出ABO血型。●环状沉淀（ringprecipitation）反应

原理：血痕中Hb和血清蛋白抗原与相应的沉淀素抗体发生特异性结合，在一定的条件下出现白色沉淀。用已知的抗人Hb血清或抗人血清与待测血痕浸出液做沉淀反应，阳性结果为人血。阴性结果不是人血。

方法：取待测血痕0.5cm2，剪碎,试管内，0.5mlNS，室温下浸泡2h，离心，取上清液作抗原液。将抗人血清或者抗人Hb血清，置毛细沉淀管下层，然后将血痕浸出液叠加在抗血清上，室温下观察30min，出现白色沉淀环为阳性。

AbAg环状沉淀示意图沉淀管内径1.5～2mm60min内出现沉淀环为阳性60min不出现沉淀环为阴性操作步骤注意事项：⑴陈旧，水洗血痕，浸泡时间不够，抗血清效价不够，会出现假阴性结果。应设置已知人血阳性对照。⑵与动物血出现交叉反应，会出现假阳性结果。应设置已知动物血痕对照。⑶检测灵敏度为1/1万~1/5万稀释血痕。采用单克隆抗体-酶联免疫吸附试验(ELISA)，灵敏度达64万倍稀释。利用DNA序列的种属特异性，以PCR-DNA分析作生物学检材的种属鉴定，无论从灵敏度或者特异性都有明显的进步。

（四）

遗传标记的检测

现场收集的血痕受外界影响是不可预知的，①发案时间不可预测；②现场检材的环境影响因素不可预测。是法医物证材料共同的特点。目前常规检测是PCR-STR分型。只要能够提取到检材的模板DNA，就可以检测出检材的的DNA遗传标记。满足取材广泛、对超微量、腐败检材的鉴定要求。

二、精斑检验

精斑（seminalstains）常见于性犯罪案件，呈灰白色浆糊状不规则斑痕。成年男子一次射精量2~5ml，精子含量1~1.5亿/ml。精子细胞蝌蚪状，分头、颈和尾三部分，长50~60

m。

（一）

预试验目的：筛选精斑。常规酸性磷酸酶试验。原理：精液中含大量的酸性磷酸酶，可以分解磷酸苯二钠，产生奈酚，奈酚经过铁氰化钾氧化后与氨基安替吡林结合，生成红色的醌类化合物。特点：⑴灵敏度高，意义在阴性结果。⑵部分内脏浸液，鼻涕、唾液、男性尿液呈弱阳性。（二）确证试验1.精子检出法2.抗人精血清沉淀反应

灵敏度2000~4000倍稀释精液。3.P30检测精液中具有前列腺特异性抗原（prostatespecificantigen），或者称γ-精浆蛋白（

-seminoprotein，

-sm），属于一种糖蛋白，PI约6.9，MW30,000，简称P30。精液P30平均含量2mg/ml。

P30具有高度特异性，用抗P30单克隆抗体，以沉淀试验，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测，阳性为精斑。

（三）精斑的遗传标记检测1.ABO血型测定：精液含丰富的可溶性ABH物质，采用吸收-抑制法测定。2.DNA遗传标记：采用PCR-STR分型。3.混合斑：混合DNA，女性成分对精液个体识别有干扰。目前采用二次裂解法或称差异裂解法：精子细胞膜—二硫交联结构—稳定。将斑迹浸出细胞，先SDS和PK处理，再用还原剂二硫苏糖醇(DTT)+SDS+PK裂解精子细胞，获得精子DNA。三、其他生物学检材的个人识别鉴定

个体识别鉴定，目前的关键的问题在生物材料的DNA提取。只要能够从材料中提取到有效量的DNA，就可以直接运用PCR-STR标准分型方法检测。种属鉴别，PCR的引物设计就已具有人特异性，一般动物的材料是没有PCR扩增产物的。值得一提的是：高度腐败，陈旧，洗涤或雨淋血痕，极其微量的物证，没有细胞核的检材，可以采用mtDNA序列多态性分析技术。后者的灵敏度比STR分析高10倍。一、概述

应用医学、遗传学的理论与技术，通过对人类遗传标记的检测和分析，判定父母和孩子是否亲生关系的法医学鉴定叫作亲权鉴定，或称亲子鉴定。多数亲权纠纷（disputedparentage）中，母子关系是确定的，要求通过鉴定证实被鉴定父亲（allegedfather,AF）与孩子（child,C）之间是否亲生关系，因此叫作父权鉴定（paternitytesting）。

在一些特殊情况下（如小孩上户口、移民等），有时需要鉴定母子间是否亲生关系，此类鉴定称为母权鉴定（maternitytesting）。有些情况下（如怀疑医院调错婴儿、拐卖儿童的认领等），夫妻双方与孩子的关系皆不明确，此时需要鉴定这一对夫妻与孩子是否具有亲生关系，此类鉴定称为双亲皆疑亲子鉴定。

亲子鉴定是法医物证学的主要任务之一，它是通过人类遗传标记的检测，按照人类遗传规律对遗传标记检测结果进行分析和判断进行的。由于高度多态性DNA标记的运用，目前的鉴定已不再仅限于父子或母子关系的鉴定，有关兄弟、姐妹、叔侄、祖孙等关系的鉴定亦能有效解决。因此，根据目前的鉴定业务所涉及的内容，使用更广义的“血缘关系鉴定”应更为合适。

目前，国内外各亲权鉴定机构几乎都采用PCR-STR分型技术，欧洲少数实验室联合应用STR和小卫星VNTR标记系统。在鉴定技术上，目前国内实验室和国外是处于同一水平。案由：离婚案件上升，涉及孩子的抚养纠纷。婚姻外性关系出现率上升，丈夫怀疑孩子不是自己亲生的。私生子。医院调错婴儿，血型测定错误。失散亲人的认亲。遗产继承纠纷。涉外婚姻及其子女的移民。超计划的生育。违纪案件强奸致孕。诱拐。个体识别。人工受精

王书德，1961年11月20日出生，福建省福清市三山乡人，妻子陈珠云，1964年8月25日出生，汉族。孩子王升鹏，1987年8月11日出生(黄石市五医院)。因B/O/A血型不符，疑心不是自己亲生。1.张晓东，1987年8月10日出生，05-389鉴定排除父子关系。2.王升鹏，1987年8月11日出生，05-395号鉴定否定父子关系。3.秦炜，1987年8月10日出生，05-406号鉴定认定父子关系。案例案例某遗产纠纷案

二、基本原理

原则：母子关系确定前提下，比对母子的基因型，可以在孩子的两个基因中找到来自生父的基因(obligatorygene，OG)。

1在肯定C的某个等位基因是来自BF，而AF不具有这个等位基因，可以排除AF是C的BF；

2在肯定C的某些基因是来自BF，而AF也具有这些基因，则不能排除他是C的BF，这时可以计算：如果认定AF是C的BF，理论上的‘把握度’有多大。TH01基因座分型检测结果表10-1A、B二等位基因系统排除和不排除亲权的组合格局MotherChildAllegedfatherPOGNotexcludedExcludedAAAAAAA,ABBBAAABBAB,BBAAABAAAAA,ABBBABABA,BAA,AB,BB—ABBBBAB,BBAABBABAAA,ABBBBBBBBAB,BBAA三、排除父子亲生关系

1非父排除率(probabilityofexclusion，PE)：是只通过某一遗传标记系统的检测，不是孩子生父的男子被排除亲生关系的概率。计算原理是考虑到M-C表型和理论上能够被排除亲生关系男子所有的表型组合，然后计算每一组合的相对机会，总机会即该遗传标记的PE。是评估某GM系统在亲子鉴定中应用效能的指标（与具体的案件无关）。

在共显性多等位基因系统(如STR座位)：

PE＝∑pi(1－pi)2＋∑∑(pipj)2(3pi＋3pj－4)

检测多个遗传标记的排除无关男子的累进机会叫作累计非父排除率

（cumulativeprobabilityofexclusion）