药物的含量测定方法与验证课件

药物的含量测定方法与验证第一节 定量分析方法的分类与特点一．容量分析法容量分析法是将已知浓度的滴定液（中国药典中称滴定液）由滴定管滴加到待测药物的溶液中，直到所加滴定液与被测药物按化学计量反应完全为止，然后根据滴定液的浓度和消耗的体积，就可以计算出被测药物的含量。容量分析的关键问题是如何确定等当点。容量分析通常用于测定高含量或中含量组分，即被测组分的含量在1％以上。容量分析法比较准确，一般情况下相对误差可达0.2％以下。容量分析法操作简便、快速、比较准确，所用仪器普通易得，在药品检验工作中具有很大的实用价值。（5）容量分析法的计算问题滴定度指每1ml某摩尔浓度的滴定液所相当的被测药物的重量。中国药典用毫克（mg）表示。2）滴定度（T）的计算在容量分析中，被测药物（B）与滴定液（A）之间都按一定的摩尔比进行反应，反应可表示为：2）滴定度（T）的计算滴定度（T）可按下式计算：M－滴定液的摩尔浓度

b－被测药物的摩尔数

a－滴定液的摩尔数B－被测药物的毫摩尔质量（分子量）3）百分含量计算在测定药物含量时，常用直接滴定法和回滴定法，其计算方法如下：a.直接滴定法此法是用滴定液直接滴定，以求得被测药物的含量。T－滴定度值

W－供试品取量V－消耗滴定液的体积在实际工作中，所配制的滴定液的摩尔浓度与药典中规定的摩尔浓度不一定恰好符合，此时就不能直接应用药典上所给出的滴定度（T），但只要乘以滴定液浓度校正因数（F）即可换算成实际的滴定度（T’），3）百分含量计算b.回滴定法（剩余滴定法）此法是先加入定量过量的滴定液A，使其与被测药物反应，待此反应进行完全后，再用另一滴定液B来回滴反应中剩余的滴定液A。b.回滴定法I.不做空白试验时百分含量计算方法VA－先加入的定量过量的滴定液A体积VB－滴定液B消耗体积FA－滴定液A浓度校正因数FB－滴定液B浓度校正因数W－供试品取量T－滴定度II.做空白试验的百分含量计算方法V0－空白试验消耗硫酸滴定液体积VB－样品测定试验消耗滴定液体积T－滴定度F－滴定液浓度校正因数W－供试品取样量（g）二．光谱分析法紫外－可见分光光度法

1）特点紫外－可见分光光度法是根据物质分子对波长为200nm～760nm这一范围的电磁波的吸收特性所建立起来的光谱分析方法。主要特点如下：a.灵敏度高，可达10-4g/ml～10-7g/ml。b.准确度高，相对误差为2％～5％。c.仪器价格较低廉，操作简单，易于普及。d.应用广泛。（1）紫外－可见分光光度法2）朗伯－比耳定律物理意义是当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时, 其吸光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度l成正比。A=lg(l/T)=EclA为吸光度,T为透光率,c为吸光物质的浓度l为吸收层厚度（1）紫外－可见分光光度法3）仪器校正和检定4）对溶剂的要求应先检查所用的溶剂在供试品所用的波长附近是否符合要求（1）紫外－可见分光光度法5）测定法a.对照品比较法Cx为供试品溶液浓度Ax为供试品溶液的吸光度cR为对照品溶液的浓度

AR为对照品溶液的吸光度为平均重量（或装量）；D为稀释体积；W为供试品取样量；B为制剂的标示量。（1）紫外－可见分光光度法5）测定法b.吸收系数法吸收系数通常应大于1005）测定法c.计算分光光度法一般不宜用作含量测定d.比色法供试品本身在紫外-可见光区没有强吸收，或在紫外区虽有吸收，但为了避免干扰或提高灵敏度，可加入适当的显色剂使反应产物的最大吸收波长移至可见光区后测定。（1）紫外－可见分光光度法（2）荧光分析法特点高灵敏度荧光自熄灭：浓度太大时，溶液会有“自熄灭” 作用，应在低浓度溶液中进行。易受干扰：必须做空白试验（2）荧光分析法2）干扰因素的排除溶剂不纯会使测定结果产生较大误差，必须做空白对照，用磨口玻璃蒸馏器蒸馏后再使用。溶液：浓度不宜过高悬浮物有散射溶氧会降低荧光强度，通惰性气体除氧pH对荧光强度有影响玻璃量器：应保持高度洁净温度：对荧光强度有影响（2）荧光分析法3）测定法浓度与荧光强度的线性关系较窄，故 应在0.5-2之间为宜，如有超过，应在调节溶液浓度后再测。1、特点与适用性高灵敏度：最低检出浓度可达10-15～10-12g/ml。高专属性：可有效分离样品中与待测组分结构相近的有关物质。高效能与高速度：用于定量分析的HPLC和GC通常可在10分钟或20分钟内完成药物的定量分析，或在30分钟内完成药物复方制剂中的多组分同时定量分析。三．色谱分析法三．色谱分析法2、分类

色谱分析法（又称层析法）根据其分离原理可分为：吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱与排阻色谱。

又可根据分离方法分为：纸色谱法、薄层色谱法、柱色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等。（一）高效液相色谱法

1、对仪器的一般要求色谱柱C18柱最常用（2）检测器最常用为紫外检测器，包括二极管阵列检测器，其他还有荧光检测器、蒸发光散射检测器、电化学检测器和质谱检测器。（3）流动相三．色谱分析法三．色谱分析法（一）高效液相色谱法

2、系统适应性试验（1）色谱柱的理论塔板数（n）：用于评价色谱柱的分离效能(2)分离度（R）：用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的分离程度，是衡量色谱系统效能的关键指标（一）高效液相色谱法

2、系统适应性试验色谱系统的重复性：用于评价连续进样中，色谱系统响应值的重复性能。色谱峰的拖尾因子：用于评价色谱峰的对称性。三．色谱分析法（一）高效液相色谱法

3、测定法（1）内标法三．色谱分析法（2）外标法：第二节 样品分析的前处理方法含金属或卤素的药物，在分析前需要经过不同方法处理后，方可进行测定。处理方法因金属或卤素在分子中结合的牢固程度而异。而含金属的有机药物，有两种情况：一是金属原子不直接与碳原子相连，通常为有机酸及酚的金属盐或配位化合物，称为含金属的有机药物。二是金属原子直接与碳原子以共价键相连接，结合状态比较牢，称为有机金属药物。一．不经有机破坏的前处理方法直接测定法经水解后测定法

1)直接回流后测定法例如：三氯叔丁醇的含量测定（银量法）2)用硫酸水解后测定法例如：硬脂酸镁含量测定（3）经氧化还原后测定法

1）碱性还原后测定法卤素结合于芳环上时，由于分子中碘的结合较

牢固，需在碱性溶液中加还原剂（如锌粉）回流，使碳－碘键断裂，形成无机碘化物后测定。例如：泛影酸含量测定（银量法）2）酸性还原后测定法例如：碘番酸含量测定一．不经有机破坏的前处理方法b．含铁药物将含铁药物加酸溶解后，便游离出Fe3＋，利用Fe3＋在酸性溶液中氧化碘化钾，析出的碘可用硫代硫酸钠滴定液滴定以测定含量。一．不经有机破坏的前处理方法（3）经氧化还原后测定法3）利用药物中可游离的金属离子的氧化性测定含量（间接碘量法）a．含锑药物二．经有机破坏的前处理方法

条件：含金属有机药物及有机卤素药物结构中的金属原子、卤素与碳原子结合牢固者，用水解或氧化还原后测定方法难以将有机结合的金属原子及卤素转变为无机的金属化合物及卤素化合物。（1）湿法破坏1）硝酸－高氯酸法本法破坏能力强，反应比较强烈。故进行破坏时，必须严密注意切勿将容器中的内容物蒸干，以免发生爆炸。本法适用于血、尿、组织等生物样品的破坏。经本法破坏后，所得的无机金属离子，一般为

高价态。本法对含氮杂环药物的破坏不够完全，此时宜选用干法烧灼进行破坏。二．经有机破坏的前处理方法（1）湿法破坏2）硝酸－硫酸法本法适用于大多数有机物质的破坏，如燃料、中间体或药物等。经本法破坏分解所得的无机金属离子均为高价态。因碱土金属可与硫酸形成不溶性的硫酸盐，

将会吸附被测定的金属离子，使测定的结果偏

低。所以本法不适用于含碱土金属有机药物的

破坏。此时，可改用硝酸－高氯酸法进行破坏。二．经有机破坏的前处理方法（1）湿法破坏3）硫酸－硫酸盐法本法所用硫酸盐为硫酸钾或硫酸钠，因硫酸钠为含水化合物，不利于有机破坏，故一般多采用硫酸钾。加入硫酸盐的目的，是为了提高硫酸的沸点，以使样品破坏完全。同时，也防止硫酸在加热过程中过早地分解为三氧化硫而损失。二．经有机破坏的前处理方法注意a.湿法破坏所用的仪器，一般为硅玻璃或硼玻璃制成的凯氏烧瓶；b.所用试剂及蒸馏水均不应含有被测金属离子或干扰测定的其它金属离子等组分；c.由于整个操作过程所用矿酸量数倍于样品，所以必须按相同条件进行空白试验校正；d.操作时应在通风櫉内进行。二．经有机破坏的前处理方法（2）干法破坏本法是将有机物灼烧灰化以达分解的目的。应注意的问题加热或灼烧时，应控制温度在420℃以下，以防止某些被测金属化合物的挥发。灰化完全与否，直接影响测定结果的准确性。

c.经本法破坏后，所得灰分往往不易溶解，但此时切勿弃去。（2）干法破坏3) 适用于湿法不易破坏完全的有机物（如含氮杂环类有机药物）以及某些不能用硫酸进行破坏的有机药物。不适用于含易挥发性金属（如汞、砷等）有机药物的破坏。（3）氧瓶燃烧法氧瓶燃烧法是将有机药物放入充满氧气的密闭的燃烧瓶中进行燃烧，并将燃烧所产生的欲测物质吸收于适当的吸收液中，然后根据欲测物质的性质，采用适宜的分析方法进行鉴别，检查或测定含卤素有机药物或含硫、氮、硒等其它元素的有机药物。本法是快速分解有机物的简单方法，它不需要复杂设备，就能够使有机化合物中的待测元素定量分解成离子型。第三节 药品质量标准分析方法验证药品质量标准分析方法验证的目的是证明采用的方法适合于相应检测要求需验证的分析项目有：鉴别试验，杂质定量或限度检查，原料药或制剂中有效成分含量测定以及制剂中其它成分（如降解产物、防腐剂等）的测定验证内容有：准确度、

精密度（包括重复性、中间精密度和重现性）、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性。1．准确度准确度是指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般以回收率（％）表示。（1）含量测定方法的准确度原料药可用已知纯度的对照品或样品进行测定，或用本法所得结果与已建立准确度的另一方法测定的结果进行比较。制剂可用含已知量被测物的各组分混合物进行测定。如不能得到制剂的全部组分，可向制剂中加入已知量的被测物进行测定，或与另一个已建立准确度的方法比较结果。3）制剂的含量测定（2）数据要求在规定范围内，至少用9次测定结果进行评价，例如制备3个不同浓度的样品，各测定3次。应报告已知加入量的回收率（％），或测定结果平均值与真实值之差及其可信限2．精密度

精密度是指在规定的测试条件下，同一个均匀样品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。含量测定和杂质定量测定考虑方法的精密度。（1）精密度表示方法偏差（deviation，d）a.b.相对误差（relative

deviation，RD）：若两份平行操作，设A、B为两次测得值，则其相对偏差为：c.最大相对偏差：相对偏差用来表示测定结果的精密度，根据对分析工作的要求不同而制订的最大值（也称“允许差”）。一般，各种含量测定的允许差如下：容量分析法为0.3％；重量分析法为0.5％；凯氏定氮法为1％；氧瓶燃烧法为0.5％；仪器分析法为3％。（1）精密度表示方法2）标准偏差（Standard

deviation，SD或S）（1）精密度表示方法3）相对标准偏差（relative

standarddeviation，RSD）也称变异系数（coefficient

of

variation，CV）（2）重复性、中间精密度及重现性重复性在相同条件下，由一个分析人员测定所得结果的精密度称为重复性。在规定范围内，至少用9次测定结果进行评价，如制备3个不同浓度的样品，各测定3次，或把被测物浓度当作100％，用至少测定6次的结果进行评价。2）中间精密度在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果的精密度，称为中间精密度。为考查随机变动因素对精密度的影响，应设计方案进行中间精密度试验。变动因素为不同日期、不同分析人员、不同设备。3）重现性在不同实验室由不同分析人员测定结果的精密度，称为重现性。当分析方法将被法定标准采用时，应进行重现性试验。如建立药典分析方法时通过协同检验得出重现性结果，协同检验的过程、重现性结果均应记载在起草说明中。（3）数据要求

均应报告标准偏差、相对标准偏差和可信限。3．专属性专属性是指在其它成分（如杂质、降解产物、辅料等）可能存在下，采用的方法能准确测定出被测物的特性。鉴别反应、杂质检查、含量测定方法，均应考查其专属性。3．专属性鉴别反应应能与可能共存的物质或结构相似化合物区分，不含被测成分的样品，以及结构相似或组分中的有关化合物，均应呈负反应。（2）含量测定和杂质测定色谱法和其它分离方法，应附代表性图谱，以说明专属性。图中应标明诸成分的位置，色谱法中的分离度应符合要求。在杂质可获得的情况下，对于含量测定，试样中可加入杂质或辅料，考查测定结果是否受干扰，并可与未加杂质和辅料的试样比较测定结果，对于杂质测定，也可向试样中加入一定量的杂质，考查杂质能否得到分离。3．专属性3）在杂质或降解产物不能获得的情况下，可将含有杂质或降解产物的试样进行测定，与另一个经验证了的或药典方法比较结果，用强光照射，高温，高湿，酸、碱水解，或氧化的方法进行加速破坏，以研究降解产物。含量测定方法应比对二法的结果，杂质测定应比对检出的杂质个数，必要时可采用光二极管阵列检测和质谱检测，进行纯度检查。4．检测限检测限（limit

of

detection，LOD）是指试样中被测物能被检测出的最低浓度或量。它无需定量测定，只要指出高于或低于该规定的浓度或量即可根据所采用的分析方法来确定检测限。4．检测限（1）常用的方法非仪器分析目视法用已知浓度的被测物，试验出能被可靠地检测出的最低浓度和量。2）仪器分析时的测定法a．当用紫外分光光度法和荧光分析法时

b．当用GC法和HPLC法时（2）数据要求应附测试图谱，说明测试过程和检测限结果。5．定量限定量限（limit

of

quantitation，LOQ）是指样品中被测物能被定量测定的最低

量，其测定结果应具一定准确度和精密

度。6．线性线性是指在设计的范围内，测试结果与

试样中被测物浓度直接呈正比系的程度。如UV法：要求浓度点为

n

=

5；吸收度A一般在0.3～0.7；相关系数r>0.9999。如HPLC法：要求浓度点为

n

=

5～7；相关系数r>0.9999。7．范围范围是指能达到一定精密度、准确度和线性、测试方法适用的高低限浓度或量的空间。耐用性耐用性是指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为常规检验提供依据。第五章 体内药物分析

体内药物分析是指体内样品（生物体液、器官或组织）中药物及其代谢物或内源性生物活性物质的定量分析。

与体内药代动力学研究和临床治疗药物监测密切相关。体内样品特点：采样量少待测物浓度低干扰物质多体内药物分析的特点：体内样品需经分离与浓集，或经化学衍生化处理后才能进行分析对分析方法的灵敏度及专属性要求较高分析工作量大，测定数据的处理和结果的阐明较为复杂。第一节 常用体内样品的制备与贮藏一、体内样品的种类包括血液、尿液、唾液、头发、脏器组织、乳汁、精液、脑脊液、泪液、胆汁、胃液、胰液、淋巴液、粪便等样品。最常用的是血浆或血清。二、体内样品的采集与制备（一）血样测定血中药物浓度通常是指测定血浆或血清中的药物浓度，而不是指含有血细胞的全血中的药物浓度。血浆浓度可作为作用部位药物浓度的可靠指标。1、血样的采集待药物在血液中分布均匀后取样通常从静脉采集血样，根据血中药物浓度和分析方法灵敏度的要求，一般每次采血1-5ml,动物实验时，采血量不宜超过动物总血量的十分之一。通常从静脉采集，有时从毛细血管采血。2、血浆的制备血浆的取得是在加肝素、构椽酸、草酸盐等抗凝剂的全血经离心后分取一般lml的全血需加0.1～0.2mg的肝素，加入血样后立即轻轻旋摇，但勿太猛烈，以免导致血细胞破裂。3、血清的制备血清是由血液中纤维蛋白原等影响下，引起血液凝结而析出的澄清黄色液体，经离心其量约为全血量的20％～40％。在室温高时，血凝过程进行得很快，宜在血凝后半小时内分离血清。当室温低时，血凝过程较慢，可将血液置37℃温度下加速血清析出。采取血样后，应及时分离血浆或血清，并最好立即进行分析。如不能立即测定时，应妥善储存。短期保存时置冰箱（4℃），长期保存时要在冷冻櫉（库）（-20℃）中冷冻保存。4、全血的制备将采集的血液置含有抗凝剂的试管中，但不经离心操作，保持血浆和血细胞处于均相，则称为全血。适用

需专门测定平均分布于血细胞内、外的药物浓度

血浆内药物浓度波动太大，又难以控制，或血浆中药物浓度很低而影响测定。（二）尿液尿样的缺点尿液中药物浓度的改变不能直接反映血药浓度，即与血药浓度相关性差；受试者的肾功能正常与否直接影响药物排泄，因而肾功能不良者不宜采集尿样；婴儿的排尿时间难于掌握；尿液不易采集完全并不易保存。（三）唾液用唾液作为样品测定药物浓度的几个优点与采取血样不同，患者制剂可以不受时间和地点的限制，很容易地反复采集；采集时无痛苦无危险；有些唾液中药物浓度可以反映血浆中游离型药物浓度。a.由于唾液是由腮腺、颌下腺及舌下腺等各腺体分泌的组成不同的混合液体，其组成也会发生经时变动；唾液中的药物浓度与血浆中的游离型药物浓度相比容易 变动；唾液中药物浓度与血浆中药物浓度的比值（S/P）只有少 数药物是恒定值；有些与蛋白结合率较高的药物，药物在唾液中的浓度比 血浆浓度低很多，需要高灵敏度的分析方法才能检测；对有些患者（如癫痫、昏迷）不能采集唾液样品。缺点（四）组织1、组织样品的制备测定前，需均匀化制成水性基质匀浆溶液，再用适当方法萃取药物。某些水中难溶的药物，也可直接使用甲醇或水-甲醇混合溶液进行组织匀浆。（四）组织2、组织样品的处理沉淀蛋白法：加入蛋白沉淀剂（甲醇、乙腈、高氯酸、三氯醋酸等），取上清液供萃取用。酸水解或碱水解法：只适用在热酸或热碱条件下稳定的少数药物（或毒物）的测定。酶水解法：最常用的酶是蛋白水解酶中的枯草菌溶素。酶水解法的特点：可避免某些药物在酸及高温下降解；对与蛋白质结合紧密的药物，可显著改善回收率；可用有机溶剂直接提取酶解液而无乳化现象生成；当采用HPLC法检测时，无需再进行过多的净化操作。（五）头发头发样品的取样方便；可获得长期长期的用药史信息。分析对象的含量低，分析样品的的预处理繁杂、干扰多。1、头发样品的采集要有代表性和同一性。

2、头发样品的洗涤3、头发样品的处理直接用甲醇提取；酸水解；碱水解；酶水解第二节 体内样品分析的前处理一、体内样品预处理的目的使待测药物游离药物进入体内后，即与血浆蛋白结合，同时部分经生物转化生成代谢物及缀合物。满足测定方法的要求体内样品介质组成复杂、干扰多，而待测药物组分浓度低，需经预处理，使其分离及浓集。改善分析环境为防止分析仪器的污染、劣化，提高测定灵敏度和选择性等。二、常用体内样品预处理方法主要应考虑生物样品的种类，被测定药物的性质和测定方法三个方面的问题。样品的分离、纯化技术应该依据生物样品的类型。根据被测定药物的结构、理化性质及药理性质、存在形式、浓度范围等，采取相应的前处理方法。样品于测定前是否需要纯化以及纯化到什么程度均与其后采用的测定方法的不同而不同。1、加入与水相混溶的有机溶剂加入水溶性的有机溶剂，可使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚，使与蛋白质结合的药物释放出来。2、加入中性盐加入中性盐，使溶液的离子强度发生变化。中性盐能将与蛋白质水合的水置换出来，从而使蛋白质脱水而沉淀。（一）去除蛋白质3、加入强酸当pH低于蛋白质的等电点时，蛋白质以阳离子形式存在。此时加入强酸，可与蛋白质阳离子形成不溶性盐而沉淀。4、热凝固法当待测物热稳定性好时，可采用加热的方法将一些热变性蛋白质沉淀。（二）分离与浓集

1）液相萃取法固相萃取法超滤法被测组分的浓集（三）缀合物的水解

1、酸水解法加入适量的盐酸溶液，比较简便、快速，但药物水解过程会分解，专一性较差2、酶解法在测定一些酸及受热不稳定的药物，常需用酶解法。最常用的酶是葡萄糖醛酸苷酶或硫酸

酯酶。药物不分解，专属性强，但时间长及酶

制剂可能引入的黏蛋白导致乳化或色谱柱阻塞。

3、溶剂解法加入溶剂在萃取过程中被分解（四）化学衍生化目的a.使药物变成具有能被分离的性质；b.提高检测的灵敏度；c.增强药物的稳定性；d.提高对光学异构体的能力。2）药物分子中含有活泼H者均可被化学衍生化，如含－COOH、－OH、－NH2、－NH－、－SH等

官能团的药物都可被衍生化。3）GC中化学衍生化法4）HPLC中化学衍生化法第三节 体内样品分析方法与方法验证一、分析方法的建立（一）分析方法的选择1