糖厂生产糖后米渣中蛋白质的提取工艺研究

糖厂生产糖后米渣中蛋白质的提取工艺研究

谷物食物是中国人民常见的食物。每天所需的蛋白质为50%70%，粮食和食品。大米蛋白是一种营养价值极高的蛋白质,其必需氨基酸构成完整,具有低过敏性,适合作婴儿配方食品,且可以防癌。但是相比于小麦蛋白,对大米蛋白这一优质植物蛋白的研究却很少。在谷物蛋白中,大米蛋白的生物价(B.V.)和蛋白价(P.V.)均比其它蛋白质高。因此,分析大米蛋白组成及其提纯工艺很有必要。按照Osborne分类方法,大米蛋白质可分为4类:清蛋白(可溶解于水的蛋白质)、球蛋白(可溶于稀盐的蛋白质)、醇溶蛋白(可溶于乙醇的蛋白质)、谷蛋白(可溶于稀酸或碱的蛋白质)。提取大米蛋白的方法很多,有碱法、酶法、复合法、排杂法和物理法等。现有文献提取大米蛋白的顺序一般为先提取清蛋白,然后是球蛋白、醇溶蛋白,最后提取谷蛋白。根据大米蛋白能溶于不同溶剂的性质,本研究采用逐步提取法分别提取米渣中4种蛋白质,并研究提取条件的影响。由于加入碱液提取米渣后,米渣发生糊化,提取出蛋白与残渣胶合,且残渣糊化严重,故本实验研究其余3种蛋白提取顺序对蛋白含量的影响。1实验部分1.1仪器、仪器和仪器米渣取自福建某味精厂,过60目筛后备用;考马斯亮蓝G-250、牛血清白蛋白、硫酸铜、葡萄糖、酒石酸钾钠、苯酚、3,5-二硝基水杨酸均为分析纯。TU-1901型紫外可见分光光度计;K-350型半自动凯氏定氮仪;80-1型离心机;RE52CS型真空旋转蒸发仪;PHS-25型酸度计;循环水真空泵;HH-4S型数显恒温水浴锅。1.2蛋白的提取和干燥本米渣是糖厂将碎米经过40℃温水浸泡,磨浆,调波美度与pH值,淀粉酶液化,105~110℃下喷射、板框过滤后得到的固体残渣,烘干后蛋白含量在55%左右。经过高温液化处理的米渣,蛋白质变性,其组分与常规大米相比发生很大变化,故需对米渣组分进行分析。1.2.1测定蛋白质含量采用考马斯亮蓝法、双缩脲比色法(液体蛋白);半自动凯氏定氮仪测定(固体蛋白)。1.2.2测定总糖含量采用DNS比色法、苯酚硫酸法测定。1.2.3脂肪含量测定采用索氏抽提法测定。1.2.4水含量测定按照GB5009.3—85测定。1.2.5测定了分权含量按照GB/T5009.4—2003测定。1.3蛋白质提取方法称取5g米渣,以料液比(g∶mL)为1∶13分别加入水、NaCl溶液、乙醇、NaOH溶液于40℃浸泡3h提取蛋白质。离心取上清液,测定蛋白含量,工艺流程见图1。2结果与讨论2.1谷蛋白的提取方案设计见表1,结果见表2。由表2数据显示,方案2提取顺序下总蛋白提取率最大,即先提取清蛋白,接着提取醇溶蛋白、球蛋白,最后提取谷蛋白。此时提取出的蛋白含量达到64.7%。文献上多采用方案1,但通过本研究表明,此顺序下提取出的球蛋白、醇溶蛋白含量确实高于方案2,但谷蛋白含量仅为61.0%,远低于方案2中的谷蛋白含量,使得总蛋白含量偏低,原因可能是采用NaCl溶液提取过球蛋白后接着提取谷蛋白,溶液中残留的Na+对谷蛋白有增溶作用,使得谷蛋白溶解度变大,提取率增大。2.2交互溶解作用由米渣蛋白定义得知,提取蛋白时,不可避免各种蛋白之间会存在交互溶解作用。例如清蛋白是能溶解于水的蛋白,那么只要其所处环境中存在水就能溶解出来。故清蛋白会溶解于一定浓度NaCl溶液或乙醇溶液。图2为提取顺序与各蛋白含量影响关系。2.2.1乙醇、nacl溶液加入顺序的分析清蛋白在乙醇、NaCl溶液中都有溶解。方案1和方案2与其他方案对比表明,在提取清蛋白前,不管先加入NaCl溶液还是乙醇溶液,清蛋白含量都低于不加入提取液,即清蛋白会溶解于乙醇、NaCl溶液。这可能是因为这2种溶液中都存在水的缘故。再对比方案3与方案5,或者对比方案4与方案6(两者提取清蛋白前,NaCl溶液、乙醇溶液加入顺序不同)数据表明,提取清蛋白前,加入乙醇溶液相比于加入NaCl溶液,清蛋白提取率变低。这说明清蛋白在乙醇溶液中溶解度更大,可能是因为在近50℃乙醇溶液中,存在着微量电离的羟基,这些基团与水中羟基一样起到溶解清蛋白的作用,这也间接说明清蛋白的溶解是由于羟基作用。2.2.2乙醇对球形溶解的影响对比方案1、方案6中球蛋白含量,结果表明,在提取球蛋白前,先加入乙醇比先加入水,球蛋白的提取率更低,造成这种现象的原因可能有2个:①球蛋白在乙醇中存在溶解;②溶液中存在的乙醇会抑制球蛋白溶解。到底是何种原因造成了这种变化呢?结合方案2、方案5中数据,我们得出,在提取球蛋白前,先加入乙醇溶液相比于先加入NaCl溶液,球蛋白提取率更高。如果溶液中存在的乙醇抑制球蛋白溶解的话,这种现象不可能发生,即球蛋白会溶解于乙醇溶液;同时方案1球蛋白含量比方案2、方案5、方案6更高,也可以间接证明此结论。2.2.3方案4:na+对醇溶蛋白的增溶作用对比方案1、方案3中醇溶蛋白含量表明,提取醇溶蛋白前,先加入NaCl溶液,醇溶蛋白溶解度比先加入水更大,这可能是溶液中存在的Na+使得醇溶蛋白溶解度增大,也就是说Na+对醇溶蛋白有增溶作用。对比其余方案中醇溶蛋白含量数据表明,提取醇溶蛋白前,先加入水还是先加入NaCl溶液,醇溶蛋白含量相差极大,方案4中醇溶蛋白含量接近方案2中含量的5倍,是方案5、方案6含量的2倍多。这也间接证明了上面的结论——清蛋白在乙醇溶液中溶解度较大。2.3清蛋白质提取条件研究2.3.1高温对提取率的影响称取5g米渣,以料液比1∶13加入去离子水,然后于0~70℃下分别提取4h,离心分离并测定上清液中蛋白含量,结果见图3。由图3可知,随着温度持续升高,清蛋白含量越来越大;当温度升至40℃后,升高趋势减缓;当温度超过60℃后,提取率不升反降。已有研究表明,高温会影响蛋白品质、口感等,所以提取不宜采用过高的温度,使其保持在30~50℃范围内较好。研究认为,40℃为提取清蛋白的较佳温度。2.3.2料液比对清蛋白含量的影响称取5g米渣,在料液比(g∶mL)为1∶5,1∶8,1∶10,1∶15,1∶20下加入水,于40℃下提取4h,离心分离,测定上清液中蛋白含量,结果见图4。由图4可知,随着料液比增加,清蛋白含量明显增加;料液比至1∶10后增加趋势渐减;清蛋白含量至料液比为1∶15后保持稳定。说明此条件能将米渣中可析出清蛋白完全浸提。对比发现,当料液比为1∶10时,清蛋白提取率已达72%,相比于料液比为1∶15和1∶20,提取率增加并不明显,故工业上为了节能,选择1∶10的料液比较适宜。2.3.3离心分离对血清蛋白提取率的影响称取5g米渣,在料液比1∶13下加入水,于40℃下分别浸提1,2,3,4,5h,离心分离后测定上清液中蛋白含量,结果见图5。由图5可知,在1~3h内,提取时间与清蛋白提取率基本呈正相关,时间超过4h后,提取率随时间增加越来越不明显。所以提取3~4h较为合适。2.3.4各因素水平的设计及结果根据以上单因素实验结果,采用L16(45)进行正交设计,表3为各因素水平设计及极差分析。A法数据。由表3可以得出,浸提清蛋白影响因素顺序为:料液比>提取温度>提取时间;提取条件较优水平为:料液比1∶13,温度45℃,提取时间3h。2.3.5测试实验在上述条件下对米渣浸提球蛋白,测得吸光度分别为0.045、0.193。此值在以上一系列实验中较大,说明正交实验确定的提取水平合适。2.3.6近地层,2.3.3%5.133于上述条件对浸提过的米渣再浸提清蛋白(同法提取2次),此时测得吸光值分别为0.010,0.004;0.041,0.021。故A法提取率为:提取率=提取出清蛋白含量米渣中清蛋白含量×100%=0.0450.045+0.010+0.004=76.3%提取率=提取出清蛋白含量米渣中清蛋白含量×100%=0.0450.045+0.010+0.004=76.3%同理,B法提取率为75.7%。2.4各因素实验正交研究过程同上,分别采用乙醇溶液、NaCl溶液提取蛋白,研究溶剂浓度、加入体积、温度以及提取时间对蛋白提取率影响单因素实验。根据单因素实验结果,设计正交得到:①乙醇溶液提取醇溶蛋白因素影响顺序为:料液比>乙醇浓度>提取时间,各因素优水平为:料液比为1∶13,乙醇浓度为63%,提取时间3h;②NaCl溶液提取球蛋白影响顺序:料液比>提取温度>NaCl溶液浓度>提取时间,料液比为1∶13,提取温度为45℃,NaCl溶液浓度5%,提取时间为3.5h。2.5通过提取谷蛋白，研究2.5.1蛋白含量的测定称取5g米渣,分别在料液比(g∶mL)为1∶5,1∶8,1∶10,1∶13,1∶15,1∶20下,加入0.09mol/LNaOH溶液,于40℃下提取3h,离心,测定上清液中蛋白含量,结果见图6。由图6可知,谷蛋白提取率随着料液比增大而增加;随着料液比持续加大,其变化越来越小。故采用料液比为(1∶11)~(1∶13)为宜。2.5.2碱液浓度对提取率的影响称取5g米渣,在料液比1∶13下分别加入浓度为0.05,0.06,0.07,0.08,0.09,0.10,0.11mol/LNaOH溶液,于40℃下提取3h,离心,测定上清液中蛋白含量,结果见图7。由图7可知,碱液浓度对蛋白提取率影响明显,即提取率总是随着碱液浓度增大而增加。有研究表明,碱浓度过高会影响蛋白乳化性、起泡性、持水性等性质,降低其食用价值。同时,浓碱提取的蛋白色泽变深(严重时甚至会变成黄褐色),发生美拉德反应,使得氨基酸与糖结合,而结合产物不易被人体吸收,从而降低蛋白营养价值。2.5.3谷蛋白的提取称取5g米渣,在料液比1∶13下加入0.09mol/LNaOH溶液,于0~60℃下提取3h,离心分离,测定上清液中蛋白含量,结果见图8。由图8可知,谷蛋白提取率大致与温度呈正相关变化,温度超过50℃后,这种相关性变弱。此时高温造成蛋白变性,变性蛋白溶解性差,使得提取率降低。所以,提取温度宜选在30~50℃。2.5.4时间对提取率的影响称取5g米渣,在料液比1∶13下加入0.10mol/LNaOH溶液,于40℃下提取1~5h,离心,测定上清液中谷蛋白含量,结果见图9。由图9可知,提取率随着时间延长而缓慢增加,表明时间对蛋白提取率的影响不明显。所以工业上可选择提取2h。本研究为更完全地提取谷蛋白,选提取时间为3~4h。2.5.5谷蛋白提取条件优化根据上述单因素实验结果,按表4设计正交实验。由表4可知,提取谷蛋白影响因素顺序为:料液比>NaOH浓度>提取温度>提取时间,各因素优水平为:料液比为1∶13,NaOH浓度0.095mol/L,提取温度45℃,提取时间4h。2.5.6测试实验在上述条件下浸提米渣中谷蛋白,测得提取率为72.5%。此值在以上一系列实验中较大,说明实验中确定的提取优水平合适。2.5.7谷蛋白提取的方差分析启动SAS软件,在程序编辑窗口输入数值,采用分析员系统中的回归分析得到表5、表6。由表5可知,服从自由度为(5,10)的F分布随机变量>31.85的概率为0.0007<0.01,所以回归方程高度显著。负相关系数为0.985,其值接近1,也表明选择的模型显著。表6给出各因素系数及标准误差。由Pr>|t|值可以看出,提取谷蛋白时,料液比及其二次项、碱浓度及其二次项对谷蛋白提取率影响显著;提取温度及其二次项、料液比与碱浓度交互作用对提取率影响显著。Pr>|t|值还表明,提取谷蛋白时,各因素影响顺序为:料液比>NaOH浓度>提取温度>提取时间,这与正交实验分析一致。由以上数据拟合得到回归方程:Y=-46.97+36.05A+30.69B+13.55C-4.61A2-3.86B2-2.24C2-2.87AB由此方程可以预测各因素在一定条件下取值时的谷蛋白提取率。还可比较预测值与理论值。对方程求导得谷蛋白提取最优条件为:料液比为1∶13.04,提取温度为44.3℃,提取时间为3.02h,此时最大提取率为87.9%。2.6白含量的测定提取米渣中4类蛋白质,分别采用考马斯亮蓝法、双缩脲法这2种比色法,及凯氏定氮仪测定蛋白含量,结果见表7。由表7可知,逐步提取米渣得到的清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白含量很低,远低于文献中提到的含量,这是因为米渣经过高温液化后变性,清、球、醇溶这三类蛋白质溶解度减小,导致提取率下降,可能还与选择的提取剂或提取工艺不成熟有关,需要在以后进行改进。3蛋白质的提取(1)通过研究,得到米渣蛋白提取顺序为:清蛋白→球蛋白→醇溶蛋白→谷蛋白。(2)分析米渣各蛋白之间交互溶解表明,清蛋白在乙醇、NaCl溶液中存在溶解,球蛋白在乙醇中存在溶解,Na+对醇溶