米根霉产淀粉糖化酶工艺研究

米根霉产淀粉糖化酶工艺研究

葡萄糖淀粉酶（ec3.2.1.3）是一种具有外切酶活性的政党杂交酶。它可以从含有非离子酶活性的葡萄糖单位中提取，并最终将淀粉转化为葡萄糖。福建红曲黄酒的酿造过程需要大量的糖化酶参与,这主要是通过添加白曲来实现的。白曲中主要的微生物有霉菌和酵母,以及少量细菌,其中霉菌以根霉为主,根霉的主要作用就是代谢产生糖化酶,用于切断大米淀粉的α-1,4糖苷键和α-1,6糖苷键,使淀粉转化为可发酵糖。因此,根霉产糖化酶能力的高低对福建红曲黄酒的发酵有至关重要的作用。目前,有多种方法可用于提高根霉菌株的产糖化酶能力,包括利用物理和化学等方法对菌株进行诱变,提升糖化酶的酶活力和酶产量;利用DNA重组技术,建立工程菌,增加工程菌糖化酶基因的拷贝数,以提高糖化酶的产量;还可以通过正交和响应面等方法优化菌株糖化酶发酵条件以达到高产的目的。本研究以前期从红曲黄酒酿造用曲中筛选出的1株糖化能力强的米根霉作为出发菌株,通过正交试验对液态发酵培养基成分进行优化及单因素试验,对发酵培养条件进行优化来提升其产糖化酶的能力,为后续将其开发成用于红曲黄酒酿造的纯种液态发酵曲奠定基础。1材料和方法1.1蘑菇前期通过分离纯化从福建白曲中获得6株米根霉,选其中1株糖化能力强的菌株M作为本研究的出发菌株。1.2灌装、冷却、灭菌斜面培养基(固态PDA培养基):将马铃薯去皮、切丁,称取200g,煮沸20~30min,经8层纱布过滤,加入1.2%琼脂粉和2%无水葡萄糖,补足蒸馏水至1L,煮沸后分装,最后121℃灭菌30min。液体种子培养基:液态PDA培养基,50mL/250mL(培养基/三角瓶)。大米液化液:300g籼米粉中加入780mL蒸馏水,浸泡搅拌2h后,添加活力为4966.9U/g耐高温液化酶2.5mL于80℃酶解1h,冷却待用。发酵培养基组分包括大米液化液、NH4Cl、KH2PO4、MgSO4·5H2O、FeSO4·7H2O、CaCO3,其最佳比例将通过正交试验确定,50mL/250mL(培养基/三角瓶)。1.3光度计、ths-32MAPADAUV-1100型紫外可见分光光度计、国华THZ-82恒温振荡器。耐高温液化酶,可溶性淀粉,3,5-二硝基水杨酸,冰醋酸,乙酸钠,吐温80,氯化钠。1.4高产糖化酶基因型人才培养先用斜面活化菌株,将其进一步扩培到茄形瓶中使其长满孢子,用无菌洗脱液洗下孢子接种于种子培养基中,当其达到对数期时,接种到设定的各种发酵培养基中置于相应的培养条件下,用于高产糖化酶探究。菌株在PDA斜面上活化4d后,挑至PDA茄形瓶中扩培4d,待其长满孢子后加入含有0.05%吐温80和0.85%氯化钠的无菌洗脱液并振荡,收集洗脱液,用血球计数板计数并调整孢子数浓度为107个/mL。取混匀的孢子液5mL至50mL的液态种子培养基中,在转速150r/min、温度27℃的摇床培养箱中培养18h,制得种子培养液。以体积比计,按5%的接种量移取种子培养液于发酵培养基中,在27℃恒温培养箱中,150r/min旋转振荡培养60h。1.5美根霉液体发酵条件的优化1.5.1培养条件确定采用L25(56)正交表探究发酵培养基中的各组分对发酵产酶的影响,调整培养基初始pH值为6,按5%(体积比)的量接种,在转速150r/min、温度27℃的摇床培养箱中培养60h后测酶活。1.5.2最佳培养条件确定的结果在最佳的发酵培养基上,通过单因素试验探究初始pH值、装液量、摇床转速、接种量和发酵温度对产酶的影响,以此确定最佳的培养条件并在该条件下跟踪糖化酶产生和累积情况,见表1。1.5.3最佳发酵工艺条件的确定在前期建立的最佳培养基组成和最优发酵条件的基础上,培养24h后,每隔6h取样测定发酵液的糖化酶活力和pH值,以此确定在最佳发酵工艺条件下,菌株的高产发酵时间。1.6糖化酶活力测定将米根霉液体发酵物混匀后过滤,取上清液进行糖化酶活力的测定,重复3次,取平均值。糖化酶活力采用比色法测定。酶活力单位的定义:1mL酶液于40℃、pH4.6的条件下,1h分解可溶性淀粉,产生1mg葡萄糖,即为1个酶活力单位,以U/mL表示。2结果与讨论2.1米根霉产糖化酶的发酵培养基发酵培养基是菌株代谢活动的物质基础。在发酵培养基中包含了作为碳源的大米液化液和氮源的NH4Cl,其他无机盐(KH2PO4、MgSO4·5H2O、FeSO4·7H2O、CaCO3)则作为菌株生长的促进因子和生命代谢的辅助因子,培养基组分对于米根霉产糖化酶的能力具有不同的影响。为考察发酵培养基中的各组分对发酵产酶的影响,采用L25(56)正交表进行试验,正交试验方案及结果见表2,方差分析见表3。表3表明,发酵培养基中,液化液浓度对发酵产糖化酶影响最为显著,其次是KH2PO4,而NH4Cl、FeSO4·7H2O、MgSO4·5H2O、CaCO3对米根霉产糖化酶并无显著影响。最优发酵培养基是:50%液化液浓度,5g/LNH4Cl,1g/LKH2PO4,0.3g/LMgSO4·5H2O,0.4g/LFeSO4·7H2O,8g/LCaCO3。在此条件下测得的糖化酶活力为158.4U/mL±4.1U/mL。2.2单因素试验确定了最佳筛选条件2.2.1初始ph值对发酵的影响培养基的pH值是微生物生长和产物合成过程中非常重要的参数。图1显示的是发酵培养基的初始pH值对菌株发酵产糖化酶活力的影响,糖化酶活力随着初始pH值在一定范围内增加而升高,当初始pH值达到7时,糖化酶活力只有略微下降。因此,在该研究条件下,发酵液的最适pH值为6.0,这与王新惠的结果相一致。2.2.2装液量对产糖化酶活力的影响米根霉是一种需氧型真菌,在其生长繁殖过程中需要供给充足的氧气,液态摇瓶发酵可以通过调整培养基装液量来控制其含氧量。图2显示的是培养基装液量对菌株发酵产糖化酶活力的影响,装液量在较低范围(30~60mL/250mL)时,随着装液量的增多酶活力逐渐升高,当装液量超过70mL/250mL后,糖化酶活力降低。装液量过小,培养基的有效成分过低,会造成菌体生长缓慢,代谢产酶少。装液量过多时,产糖化酶也会下降,这可能是因为装液量过多而影响了通气量及通气效果。当装液量为50mL/250mL(糖化酶活力为160.4U/mL)和60mL/250mL(糖化酶活力为168.0U/mL)时,两者之间糖化酶活力并没有显著差异,考虑原料的利用率,该研究条件下,米根霉的最适装液量为50mL。2.2.3转速对糖化酶活力的影响除装液量外,摇床转速对溶氧的影响也很大。图3显示的是摇床转速对菌株发酵产糖化酶活力的影响,当摇床转速从100r/min提高到150r/min,糖化酶活力显著升高,这可能是由于在一定范围内,转速的提高会增大溶氧,从而促进菌体代谢使得糖化酶活力升高。当转速提高到200r/min以上,糖化酶活力反而下降,这可能是由于要摇床转速过高,菌丝体生长繁殖过快,导致菌丝体容易成团及后期的衰老加速,从而不利于代谢产生糖化酶。因此该研究条件下的最佳转速为150r/min。2.2.4接种量对菌株糖化酶活力的影响接种量对微生物发酵周期以及代谢产物形成具有显著的影响。图4显示的是接种量对菌株发酵产糖化酶活力的影响,在低接种量范围(4%~6%),该菌株的糖化酶活力随着接种量的增加而升高;而在接种量升到7%和8%时,糖化酶活力下降,但两者之间没有显著差异。这可能是由于接种量过大,菌体生长繁殖快,在相同营养条件下较早进入衰老期,同样不利于代谢产物的合成分泌。因此,合适的接种量有利于发酵在较短的时间内获得足够的菌体,进而有利于各种代谢产物的产生。因此该研究条件下米根霉的最佳接种量为6%(v/v)。2.2.5温度对糖化酶活力的影响发酵温度影响菌体生长和代谢过程的酶活。图5显示的是发酵温度对菌株发酵产糖化酶活力的影响,在一定范围内(22~32℃),随着温度的升高,糖化酶活力也随之上升。但是当温度达到37℃时,糖化酶活力出现下降的趋势。这是因为一般发酵温度与菌体内酶的反应速率呈正相关,即发酵温度越高,菌体内酶的反应速率越快,使得发酵周期提前;但当温度过高时,酶的活性很容易失活,导致菌体衰老,不利于后期代谢产物的合成与分泌。因此,最佳的发酵温度为32℃,此时糖化酶活力达到191.2U/mL±16.0U/mL。2.3发酵过程中糖化酶活力和发酵液ph值的变化在前期建立的最佳培养基组成和最优发酵条件的基础上,进一步确定最佳发酵工艺条件下该菌株的最佳发酵时间。随着发酵时间的延长,发酵液中糖化酶活力和发酵液pH值均出现明显变化(见图6)。糖化酶活力随发酵时间的延长呈现逐渐增加的趋势,发酵48h时达到最大值(196.6U/mL±8.1U/mL);48~60h,糖化酶活力变化不大;60h之后,糖化酶活力呈下降的趋势。而发酵液的pH值在12~36h期间随着发酵时间的延长呈下降趋势;当36h之后达到稳定水平。3菌株糖化酶活力检测以实验室前期筛选出的高产糖化酶的米根霉菌株M作为出发菌株,以发酵液的糖化酶活力为指标,通过正交试验,确定了摇瓶发酵的最佳培养基成分为:液化液浓度50%,NH4Cl5g/L,KH2PO41g/L,MgSO4·5H2O0.3g/L,FeSO4·7H2O0.4g/L,CaCO38g/L;通过单因素试验,