锰对米氏凯伦藻叶绿素荧光特性及生长的影响

锰对米氏凯伦藻叶绿素荧光特性及生长的影响

人类活动严重阻碍了水生生态系统的形成，导致世界著名的有害浪潮肆虐。富营养化与赤潮的发生有密切关系,对海洋生态系统中的群落演替及适应种的大量繁殖最后爆发赤潮起着关键性的作用。有研究表明微量元素锰是赤潮形成和爆发的原因之一。早在20世纪30年代,Hopkins证明小球藻的生长必须有锰的存在,随后发现锰与光合作用有关。锰是叶绿素合成过程中酶促反应的辅因子,并存在于植物光系统Ⅱ(PSⅡ)的放氧复合体上,在光合电子传递中参与水的光解作用,维护叶绿体膜的结构。在营养盐浓度较低的外海,锰常成为浮游植物生长的限制因子。以往的研究也证明了锰对藻类的生长有显著影响,如锰缺乏可导致叶绿素水平下降,类囊体结构被破坏,片层叠垛程度降低,细胞产生光合作用缺陷,失去PSⅡ活性等[6,7,8,9,10,11,12,13,7,10,11]。植物叶绿素荧光动力学技术能够快速灵敏、无损伤地反映PSⅡ的状况以及植物对光能的吸收、传递、耗散、分配等“内在性”的特点,是研究植物光合生理方法及植物与逆境胁迫关系的理想探针[14,15,16,17,15,16,17]。其中Fv/Fm表示PSⅡ最大光化学量子产量,随环境变化较大,是最常用的叶绿素荧光参数。但利用此技术分析锰对赤潮藻光合作用的影响尚未见报道。米氏凯伦藻是常见的赤潮甲藻,分布广泛,能分泌溶血性毒素和鱼毒素,有溶解鱼类鳃组织细胞的作用,近年来已经在日本、欧洲沿岸及我国渤海、南海等海域多次引发大规模赤潮灾害,造成了生态系统和环境的破坏。研究米氏凯伦藻对锰的生理生态响应,揭示锰在赤潮发生过程中的作用机制,对于改善海洋环境质量,维护海洋生态安全,有着重要的实际意义。本文利用叶绿素荧光技术研究了不同锰浓度对米氏凯伦藻叶绿素荧光特性及生长的影响,以期为赤潮的爆发机制研究提供理论基础,并对赤潮的预报和防治提供科学依据。1材料和方法1.1藻类藻类米氏凯伦藻Kareniamikimotoi(MACC/D23)由中国海洋大学微藻种质库提供。1.2实验藻株的获取锰实验在500mL的PC(聚碳酸酯)三角瓶中进行,采用不含锰的人工海水,在(22±1)℃、盐度28的f/2培养基中进行培养。将实验藻种3000r/min离心10min,然后用无锰的培养液洗涤3次去锰。接种前将实验藻株在无锰的f/2培养液中培养1周时间。以MnSO4·H2O作为锰源,对经洗涤和饥饿后的实验藻株进行不同锰浓度(10-12,10-10,10-8,10-6,10-4mol/L)的培养实验,接种后的初始细胞密度分别为:(3.2500±0.4330)、(3.4167±0.1443)、(3.5833±0.1443)、(3.6667±0.3819)、(2.5833±0.3819)×104cells/mL。每个浓度设3个平行组,光照周期为16L∶8D,光照强度为5000lx,培养周期为11d。每日随机调换三角瓶位置,摇瓶2—3次并定时取样。1.3叶绿素含量测定叶绿素各荧光参数和叶绿素相对含量的测定采用德国Walz公司产Water-PAM水样叶绿素荧光仪(Walz,Effeltrich,Germany),按照梁英等的方法进行。文中的叶绿素含量用相对含量表示,即每次测得的叶绿素含量与接种时叶绿素含量的比值。每个样品测定4次,取平均值。叶绿素荧光的主要参数包括:Fo基础荧光,Fm最大荧光,Fv可变荧光,Fv/Fm最大光化学效率,Fv/FoPSⅡ潜在活性,ΦPSⅡ实际光能转化效率,ETR电子传递速率,qP光化学淬灭,NPQ非光化学淬灭。1.4密度的测定。对于密度每日定时取样,采用血球计数板法进行细胞密度的测定。每个样品计数3次,取平均值。3次计数数据的标准差控制在15%以内,若超出15%,则删除该数据,重新取样计数。1.5关性分析软件单因子方差分析、LSD多重比较及相关性分析采用SPSS11.5软件(P<0.05表示差异显著)。作图采用Sigmaplotl0.0软件。2结果2.1米氏凯伦藻的荧光参数与细胞密度的关系锰浓度(10-12—10-4mol/L)对米氏凯伦藻叶绿素荧光参数的影响见图1(A—F)。结果显示,锰浓度对米氏凯伦藻各叶绿素荧光参数(Fv/Fm,Fv/Fo,ΦPSⅡ,ETR,qP,NPQ)均有显著影响(P<0.05)。各荧光参数与锰浓度之间的关系与培养天数有关,其中10-4mol/L浓度组的Fv/Fm和Fv/Fo值在第2,4,5,8天显著高于其它浓度组,ΦPSⅡ和ETR与其它浓度组相比变化不大。在培养周期的第3—9天,Fv/Fm,Fv/Fo,ΦPSⅡ,ETR在10-12—10-8mol/L锰浓度间随着起始锰浓度的增加而升高(见图1A-D);10-12mol/L浓度组的Fv/Fm和Fv/Fo在第2—7天随培养时间的延长而增加,ΦPSⅡ和ETR在整个培养周期内呈现缓慢增加趋势但变化不大;10-10和10-8mol/L浓度组的Fv/Fm和Fv/Fo在第2—9天随培养时间的延长而增加,ΦPSⅡ和ETR在整个培养周期内则呈现下降—恢复—再下降趋势;10-6mol/L浓度组的Fv/Fm和Fv/Fo在第2—7天随培养时间的延长而增加,ΦPSⅡ和ETR自接种后第1天到第5天均呈明显上升趋势,随后开始下降;10-4mol/L浓度组的Fv/Fm和Fv/Fo,在第1—4天缓慢上升,随后即呈现明显下降趋势,ΦPSⅡ和ETR则在第1—7天呈上升趋势,随后开始下降。(图1A—D)。qP值在第5天和第8—11天随锰浓度的升高而降低,10-4mol/L浓度组的qP值自接种后第1天即开始下降,第6天开始恢复,并在第8天和第10天显著低于其它浓度组;各浓度组的NPQ均呈现先下降后上升趋势,其中10-4mol/L浓度组的NPQ值在培养后期的第8—9天显著低于其它浓度组(图1E—F)。米氏凯伦藻的荧光参数与锰浓度之间的相关关系见表1。锰浓度为10-12—10-8mol/L时,米氏凯伦藻的Fv/Fm,Fv/F0在培养的第4—5天与锰浓度呈显著的正相关关系(P<0.05),第11天时ΦPSⅡ和锰浓度呈显著的负相关关系,qP在第8天时与锰浓度呈极显著的负相关关系(P<0.01),在第9天时与锰浓度呈显著的负相关关系。锰浓度为10-8—10-4mol/L时,Fv/Fm,Fv/F0在第3—6天与锰浓度呈显著正相关关系,第8天时则呈极显著正相关关系;ΦPSⅡ在第8天时与锰浓度呈显著正相关关系;ETR则在第8天时与锰浓度呈极显著正相关关系;qP在第8—9天与锰浓度呈极显著负相关关系;NPQ在第8—9天与锰浓度呈极显著负相关关系,第11天时呈显著负相关关系。米氏凯伦藻的荧光参数与细胞密度之间的相关关系见表2。由表2可以看出,各荧光参数与细胞密度的相关性与培养天数有关,Fv/Fm,Fv/F0在培养的第5,6,9天与细胞密度呈显著负相关关系,第8天呈极显著负相关关系;ΦPSⅡ和ETR在第8天时与细胞密度呈显著负相关关系,第6天则呈极显著负相关关系;qP在第8—10天与细胞密度呈显著正相关关系,NPQ在第8—9天与细胞密度呈极显著正相关关系。2.2锰浓度对叶绿素含量的影响锰浓度对米氏凯伦藻叶绿素相对含量的影响见图1(G)。结果显示,从第2天至培养结束,锰浓度对叶绿素相对含量均有显著影响(P<0.05),各锰浓度组的叶绿素相对含量随培养时间的延长而增加。从第2天开始至培养结束,10-4mol/L浓度组的叶绿素相对含量均显著低于其它浓度组。在10-12—10-8mol/L间,叶绿素相对含量在第3天和第6天随锰浓度升高而升高,其它时间随锰浓度变化不大;在10-8—10-4mol/L间则在整个培养周期内均随锰浓度的进一步升高而明显降低。叶绿素相对含量的最高值均出现在10-8mol/L浓度组。米氏凯伦藻的叶绿素相对含量与锰浓度之间的相关关系见表1,锰浓度为10-12—10-8mol/L时,叶绿素相对含量与锰浓度在第3天和第6天呈极显著正相关关系,在第2天和第4天呈显著正相关关系。锰浓度为10-8—10-4mol/L时,叶绿素相对含量在接种后的第1天即和锰浓度呈现显著负相关关系,自接种后第2天到培养结束的整个周期内,叶绿素相对含量与锰浓度呈极显著的负相关关系。米氏凯伦藻的叶绿素相对含量与细胞密度之间的相关关系见表2。结果显示,从接种后第二天开始至培养结束,叶绿素相对含量与细胞密度呈极显著正相关关系(P<0.01)。2.3细胞密度与锰浓度的相关性锰浓度对米氏凯伦藻细胞密度的影响见图1(H),方差分析及多重比较结果显示,锰浓度对整个培养周期内的米氏凯伦藻细胞密度均有显著影响(P<0.05)。各锰浓度组的细胞密度自培养周期的第3天开始进入指数增长期,至第9天结束。自第4天开始至培养结束细胞密度在10-12—10-8mol/L间随锰浓度升高而升高,在10-8—10-4mol/L间随锰浓度的进一步升高而降低。其中10-4mol/L锰浓度组的细胞密度在整个培养周期内均显著低于其它浓度组。米氏凯伦藻的细胞密度与锰浓度之间的相关关系见表1,锰浓度为10-12—10-8mol/L时,细胞密度与锰浓度之间的关系和培养天数有关,在第4天和第8天二者呈极显著正相关关系(P<0.01),在第2,3,5,6,9,11天呈显著正相关关系(P<0.05)。锰浓度为10-8—10-4mol/L时,细胞密度在第1天和第3天与锰浓度呈现显著负相关关系,自第4天到培养结束,细胞密度与锰浓度之间均呈现极显著的负相关关系。3m2和m2对微藻叶绿素荧光特性的影响锰(Mn)是放氧复合物(OEC)的组分,是参与光合过程的一种重要微量元素。锰过高可导致微藻细胞原生质质量增加,叶绿体形状和类囊体结构失常,叶绿素a和b的比例下降,由外周天线蛋白(LHCⅡ)到PSⅡ的荧光发射比例增加;锰缺乏则可能对PSⅡ产生两种影响:一方面OEC脱落,PSⅡ反应中心结构发生变化;另一方面可能阻断了从OEC到反应中心的电子传递,这两种情况都有可能导致光合速率降低,产生过剩激发能,抑制藻类生长。实验结果表明,在米氏凯伦藻整个培养周期中,叶绿素相对含量和细胞密度在10-12—10-8mol/L锰浓度间均随着起始锰浓度的增大而增大,在锰浓度为10-8mol/L时达到最大值,在10-8—10-4mol/L锰浓度间随锰浓度的进一步升高而降低。10-12mol/L和10-4mol/L处理组的细胞密度和叶绿素相对含量在整个培养周期均显著低于其它处理组,表明低锰和高锰处理对米氏凯伦藻的生长均有明显的抑制作用,其他学者也进行了一些相关的研究。黄邦钦等的研究结果表明锰浓度对塔玛亚历山大藻(Alexandriumtamarense)的细胞大小和生长有显著影响,揭示了微量元素锰是触发赤潮发生的重要因子之一。Allen等研究了锰缺乏对莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)的生长和生理活性的影响,结果表明Mn2+<0.5μmol/L时,细胞分裂变慢,叶绿素含量减少,生长以较低密度到达稳定期,Mn2+<0.1μmol/L时,细胞产生光合作用缺陷,失去PSⅡ活性。Knauer等的研究表明,Mn2+<0.001μmol/L时斜生栅藻(Scenedesmussubspicatus)细胞生长受限,Mn2+>10μmol/L时,细胞生长受到抑制,最适锰浓度为0.001—0.1μmol/L。秦晓明等认为锰对赤潮生物锥状斯氏藻的生长有促进作用,李灏等的研究表明Mn2+浓度为l8—36μg/L时亚历山大藻(Alexandriumsp.LC3)可获得较快的生长速率,Sunda等的研究表明Mn2+能够促进聚生角毛藻(Chaetocerossocialis)的生长。Kessler发现Chlorellavulgaris在锰缺乏条件下迅速失去绿色,叶绿素含量下降,类囊体结构被破坏,生长受到抑制,和高等植物的反应一致。杨中宝等认为高Mn抑制植物生长的原因还在于Mn竞争了二价阳离子结合位点,从而减少Ca2+、Mg2+及Fe2+的吸收。本实验结果表明,锰浓度对整个培养周期内的米氏凯伦藻细胞密度均有显著影响(P<0.05),其中高锰浓度组(10-4mol/L)的细胞密度在整个培养周期内均显著低于其它浓度组。叶绿素含量与光合作用有密切的关系,微藻受伤害后会引起叶绿素含量下降,因此是反映藻类生理状况的重要指标。本实验结果表明,起始锰浓度为10-8mol/L时,米氏凯伦藻的叶绿素含量最高,低于或高于这个浓度时,叶绿素含量均有不同程度的下降,10-4mol/L时叶绿素相对含量和细胞密度在整个培养周期均显著低于其它处理组,说明低锰和高锰使微藻受到伤害,起始锰浓度越高,微藻受伤害的程度越大,这与Allen等,Knauer等及Kessler的研究结果相符。叶绿素荧光分析技术常用于检测植物光合机构适应环境胁迫的能力。叶绿素荧光的主要参数包括:最大光化学效率Fv/Fm、PSⅡ潜在活性Fv/Fo、实际光能转化效率ΦPSⅡ、电子传递速率ETR、光化学淬灭qP和非光化学淬灭NPQ。其中Fo为基础荧光,Fm为最大荧光,Fv为可变荧光。有关锰对于海洋微藻叶绿素荧光特性的影响尚未见报道。Paul等研究了锰对于几种地衣叶绿素荧光的影响,结果表明高锰明显降低其ΦPSⅡ和NPQ,qP的变化则因种而异,ΦPSⅡ的降低表明高锰降低了地衣植物的光合能力,并引起叶绿素浓度的下降以及类囊体的衰退。史庆华等的研究结果表明强光下的高锰处理能够显著降低黄瓜植株的Fv/Fm、ΦPSⅡ和qP。姜闯道等报道了强光下缺锰引起大豆叶片的Fv/Fm、qP及qE(高能态猝灭)的降低,认为qE的降低是由于缺锰导致叶黄素脱环氧化程度减少所致,而正常情况下qE是NPQ的最主要组分。本实验结果表明,在培养周期的第3—9天,叶绿素荧光参数Fv/Fm,Fv/Fo,ΦPSⅡ,ETR在10-12—10-8mol/L锰浓度间随着起始锰浓度的增大呈增加趋势,表明10-8mol/L锰浓度组的米氏凯伦藻PSⅡ具有高光能转化效率、实际光能转化效率、表观电子传递速率以及潜在活性。其中10-12mol/L浓度组的Fv/Fm,Fv/Fo,ΦPSⅡ和ETR值较低表明低锰处理使米氏凯伦藻PSⅡ活性降低,光能利用效能和转化效率下降。Fv/Fm和Fv/Fo值较低表明非光化学能量耗散加强,细胞光能利用率降低,低锰胁迫使PSⅡ潜在活性中心受损,抑制了光合作用的原初反应;ΦPSⅡ的降低表明原初电子受体还原效率降低,说明PSⅡ的供体和受体可能都遭到破坏;ETR值降低表明电子传递受阻,电子传递受阻后,会影响PSⅡ反应中心无法正常接受光子,光子累积到一定程度产生光抑制,也就使藻细胞的同化力(NADPH和ATP)无法正常形成,从而影响了对碳的固定和同化。10-4mol/L锰浓度组的Fv/Fm,Fv/Fo,ΦPSⅡ和ETR均在第1—4天缓慢上升,从第5天开始即表现出明显下降趋势,下降幅度随培养时间而逐步增大,表明随高锰胁迫时间的延长,米氏凯伦藻的PSⅡ光能转化效率及电子传递活性受到一定的抑制。但10-4mol/L浓度组的Fv/Fm和Fv/Fo值在第2,4,5,8天均显著高于其它浓度组,ΦPSⅡ,ETR与其它浓度组相比变化不大,表明米氏凯伦藻的PSⅡ活性对高锰有一定的耐受性,其可能的机制是细胞可以将大量的锰排斥在外,对于进入细胞内的锰则通过光合作用器官产生形态及