第1次课17 1 3蛋白质提取

1第五章实验

29蛋白质提取2目

的

中医药防治疾病，大多与改变目的组织中有关基因的表达产物——蛋白质有关，为了研究这些蛋白质的表达数量、结构与功能，蛋白质提取是首务。3原理

本实验采用SMMC7721人肝癌细胞，采用蛋白裂解液（RIPAbuffer）破坏细胞膜，通过震荡，令细胞内蛋白质充分释放。离心除去细胞膜等，收获含有蛋白质的上清。通常蛋白裂解液含有表面活性剂，如SDS、TritonX-100等，用以改变细胞壁或膜的通透性，促进内含物渗透出来；为了减少蛋白质变性，在整个实验中往往采用Tris等缓冲液；而低温操作和添加蛋白酶抑制剂，如苯甲基磺酰氟（PMSF）、抑肽素A等，有助于降低蛋白质的水解、提高提取率。4实验准备

1．主要器材

常规细胞培养设备等。

2．主要试剂

（1）蛋白裂解液（RIPAbuffer，100ml）

（2）蛋白定量试剂盒（BCAProteinAssayKit）：包含A液和B液。

（3）蛋白标准品：小牛血清标准品溶液（BSA，2mg/ml）5

（4）5×上样缓冲液（SDS）

0.5mol/LTris-HCl（pH6.8） 2.5ml

二硫叔糖醇（DTT，MW154.5）0.39g

SDS 0.5g

溴酚蓝 0.025g

甘油 2.5ml

混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存。

3．实验材料

1个100mm皿100％融合度的SMMC7721肝癌细胞。6实验步骤

1．吸弃培养液。每100mm皿加1mlPBS，轻柔摇晃洗涤细胞，然后吸弃PBS，重复以上操作两次。

2．加1ml蛋白裂解液，于冰上裂解20min，期间经常摇动。收集细胞碎片和裂解液至1.5ml离心管中。

3．4℃，12000rpm离心15min。取上清，插入冰中。

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4．BSA标准溶液的配置（0.125～2µg/µl）约20min：试管号Con（ug/ul）RIPAbuffer（ul）BSA（ul）12.000030021.50012537531.00032532540.750175175取自#2试管50.500325325取自#3试管60.250325325取自#5试管70.125325325取自#6试管80.00040008

5．根据所有的标准品和样本数量，计算所需BCA工作液（按200µl/孔）。

6．配制BCA工作液：50体积A液+1体积B液。

7．96孔板，每孔加标准品溶液和未知浓度样品各10µl。

8．每孔加BCA工作液200µl/孔。

9．轻柔摇晃培养板，置于37℃烘箱20～30min。

10．紫外分光光度计562nm下测定蛋白浓度。

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11．制作标准曲线，计算各样本蛋白浓度：注：Y值为酶标仪测得的OD值，X值为蛋白浓度（µg/µl）。方程:y=a+b*xa=0.11395；b=0.49998；r^2=0.9918810

12．取蛋白样品20µg，添加5×上样缓冲液（如下表）：

13．沸水浴5分钟，以使蛋白变性。

14．快速离心一下样品，-20℃保存，备用。样本编号Y值X值上样量（µl）上样缓冲液（µl，5×）总体积10.921.6212.303.0815.38211实验结果

1．100mm皿100％融合度的SMMC7721肝癌细胞，约可以收获1400µg蛋白。

2．标准曲线同前。

3．据上表确定浓度的各抽提蛋白样本。

4．得到不同溶于5×上样缓冲液的若干待检样本。12注意事项

1．通常在组织均质化后，亚细胞结构中的蛋白酶会释放到溶液中降解蛋白质。因此，缓冲液和离心机需提前预冷，低温操作很重要，而且有利于维持蛋白质活性。

2．本实验采用蛋白裂解液中含有PMSF、EDTA等蛋白酶抑制剂。为达到更好效果也可使用鸡尾酒式抑制剂（complet