园艺植物组培基本操作技术-无菌操作

模块三组培基本操作技术项目二无菌操作123CONTENTS接种用品准备外植体选择和处理无菌操作项目一无菌操作三、无菌操作（一）接种含义将无菌材料在无菌环境中切割或分离后转入无菌培养基上的过程。又称无菌操作。（二）接种方法竖插法横插法三、无菌操作（三）操作规程A.接种前4h接种室灭菌;B.接种前20min打开紫外灯;C.接种员洗手，在缓冲间换鞋、穿好实验服;D.关紫外灯，开日光灯及风机，擦双手及台面;E.擦拭接种工具并反复灼烧，烘烤培养皿;F.接种完，清理台面并标识;三、无菌操作三、无菌操作三、无菌操作三、无菌操作三、无菌操作三、无菌操作项目二无菌操作模块三组培基本操作技术12CONTENTS外植体选择和处理项目二无菌操作3接种用品准备无菌操作（一）灭菌与消毒的区别灭菌消毒灭菌：用理化方法杀死物体表面和孔隙内一切微生物或生物体。消毒：杀死、消除或抑制部分微生物，使之不发生作用。思考：灭菌和消毒有何区别？

一、接种用品准备物理灭菌过滤灭菌热力灭菌辐射灭菌干热灭菌湿热灭菌电离辐射紫外辐射超声波微波灼烧灭菌煮沸灭菌烘烤灭菌高压蒸汽灭菌（二）消毒方法

一、接种用品准备

一、接种用品准备

一、接种用品准备化学灭菌熏蒸灭菌喷雾灭菌涂擦灭菌浸泡灭菌5-8ml/m3甲醛+5g/m3

高锰酸钾；或冰醋酸加热。70%酒精；0.1-0.2%新洁尔灭。各种表面消毒剂同喷雾灭菌

一、接种用品准备

一、接种用品准备

1.环境灭菌◆培养室灭菌◆接种室灭菌（三）组培灭菌方法例举

一、接种用品准备接种室灭菌方法超净台喷雾消毒:75%酒精。紫外灯照射：波长260nm，距离小于1.2m，20-30min。臭氧灭菌机：1-2h。熏蒸灭菌:5-8ml/m3甲醛+5g/m3高锰酸钾；冰醋酸；1-3%高锰酸钾或3%来苏儿。

一、接种用品准备培养室灭菌方法新建培养室用前一定要彻底熏蒸1次。隔2-5d用洗衣粉水或3%来苏水拖地1次，用0.1-1.0%高锰酸钾液擦架1次。

一、接种用品准备

2.培养基灭菌高压湿热灭菌某些激素、维生素采用过滤灭菌

一、接种用品准备1.外桶2.锅盖3.安全阀4.排气阀5.气压表6.内桶7.排气软管8.支架手提式高压湿热灭菌锅

一、接种用品准备手提式高压湿热灭菌方法装锅加水封盖通电加热排冷空气升温保压断电降压出锅冷却

一、接种用品准备

自动高压湿热灭菌锅电源水位指示灯温度、压力显示窗温度压力设置钮压力表放汽阀

一、接种用品准备装锅加水封外盖升温排冷气升温保压降压出锅冷却

自动高压湿热灭菌方法通电设置参数封内盖

一、接种用品准备

培养基高压灭菌所必需的最少时间

容器体积(mL)121℃灭菌所需最少时间(min)

20-5015

100030

250-50025

75-15020

一、接种用品准备

过滤灭菌滤膜Ø0.45um以下1.过滤器先灭菌，灭菌温度不超过121℃。2.溶液先进行初滤(滤膜Ø0.65um)

一、接种用品准备3.培养用品及器具等的灭菌消毒方法玻璃器皿灭菌接种工具灭菌实验服、口罩、滤纸灭菌物体表面灭菌玻璃器皿及量具的清洗消毒

一、接种用品准备玻璃器皿灭菌干热灭菌：160-180℃,1.5-2.0h湿热灭菌：121℃,20-40min接种前用酒精棉球擦试消毒，并灼烧灭菌。

一、接种用品准备接种工具灭菌用前干热灭菌：160-180℃,1.5-2.0h用前湿热灭菌：121℃,20-30min接种前用酒精棉球擦试，浸入95%酒精液中，并灼烧灭菌。

一、接种用品准备湿热灭菌：121℃,20-30min实验服灭菌后置于缓冲间或密封好。实验服、口罩、滤纸灭菌

一、接种用品准备物体表面灭菌灭菌方式：喷雾、涂抹杀菌消毒剂：70%酒精；1-2%来苏水；0.1-2%新洁尔灭；洗衣粉；吐温-80应用：桌面、墙面、双手、材料表面

一、接种用品准备

复习思考题1.灭菌与消毒有何区别？2.如何理解组培必须建立“无菌概念”？3.组培常用的灭菌方法有哪些？如何灭菌？4.怎样进行培养基的高压湿热灭菌?

一、接种用品准备项目二无菌操作模块三组培基本操作技术123CONTENTS接种用品准备外植体选择和处理无菌操作项目二无菌操作二、外植体选择和处理(1)根据培养目的选择(2)具有代表性（一）外植体的选择原则：二、外植体选择和处理幼嫩茎尖营养芽二、外植体选择和处理◆选择优良的种质（即基因型）＞＞二、外植体选择和处理◆选择生理状态良好的材料二、外植体选择和处理◆在生长开始的季节选取二、外植体选择和处理◆材料生长健壮、无病虫害二、外植体选择和处理◆确定合适的取材部位◆考虑：◆最好做对比试验来源培养难易培养途径与变异性二、外植体选择和处理◆选择合适的外植体大小培养目的外植体大小胚胎培养或脱毒快速繁殖宜小宜大外植体大小(一般0.5-1.0cm)叶片、花瓣等茎段茎尖分生组织5mm×5mm1-2个茎节0.2-0.5mm带1-2叶原基二、外植体选择和处理（二）接种材料预处理(1)接种材料预培养(2)就地套袋(3)接种材料修整与冲洗(4)消毒二、外植体选择和处理

接种材料修整与冲洗二、外植体选择和处理消毒70%酒精浸泡10-30s0.1-1%升汞5-8min。用化学灭菌剂浸润灭菌，消毒剂处理（可加吐温活性剂）无菌水冲洗3-10次接种消毒原则：杀死材料表面的全部微生物，又不损伤或只轻微损伤植物材料。消毒液要浸没材料流水冲洗或洗衣粉漂洗二、外植体选择和处理灭菌剂使用浓度消毒时间/min去除的难易效果酒精过氧化氢漂白粉次氯酸钙70%~75%10%~12%饱和溶液9%~10%0.5~25~105~305~30易最易易易好好