医学细胞生物学设计型实验设计报告

医学细胞生物学设计型实验设计报告实验项目：利用聚乙二醇（简称PEG）为介导物进行细胞融合实验原理：细胞融合（cellfusion）是指两个或多个细胞通过质膜融合形成单个双核或多核细胞的现象称为细胞融合，结果产生杂交细胞（hybrid）亲本相同的融合细胞称为同核体，反之称为异核体。细胞的融合是利用了细胞膜的流动性，在外界诱导作用下（常用的有灭活的仙台病毒、PEG、电刺激等）各类细胞的膜结构发生改变，使两细胞接触点处脂膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，使细胞发生融合。所以本次实验利用聚乙二醇的此性质，改变蟾蜍的血细胞膜的结构，进行细胞融合。本次实验实验所用蟾蜍的血细胞，其原因有：1、蟾蜍血便宜，是单个散在性的细胞，不需要解离。2、蟾蜍血细胞具有细胞核，便于对融合细胞进行鉴定。如果经过融合的细胞经镜检观察仍然只有一个细胞核那么即为未融合，如果经过融合的细胞经镜检观察有两个或者两个以上的细胞核即为融合成功了的细胞。实验步骤：1、先将蟾蜍处死取蟾蜍血2ml和2mlAlsver液混合后，再加上6mlAlsver混匀后制悬液。（可在4℃下保存2、取①溶液1ml加上4ml0.85%的NaCl溶液进行一下两次离心处理。=1\*GB3①1200r/min离心5min(去上清液再加入5ml的0.85%NaCl溶液=2\*GB3②1000-1200r/min离心5min3、将上步最后一次的沉降雪球（去上清液后，约0.1-0.2ml）,加入GKN液，至1-2ml使之成10%的细胞悬液）4、取上述10%的血球悬液1ml,加入3mlGKN液，使每毫升含血球15000万个，即15×107个/ml5、取步骤4中所得悬液1ml+0.5ml的PEG液，均匀滴片，在常温下2-3min后即可镜下观察。预期结果：在高倍镜下可以看到两个或两个以上的蟾蜍血红细胞融合在一起。教师：日期：实验仪器、设备、器具表名称规格、型号数量说明显微镜普通光学显微镜1台用于镜检离心机普通离心机1台用于提取血细胞水浴箱恒温水浴箱1台用于恒温水浴加热离心管50ml2支用于提取血细胞滴管胶头1支用于粗略取用液体载玻片2.5cm*7.5cm1张用于制作涂片盖玻片2cm*2cm1张用于制作涂片实验试剂表名称规格用量说明Alsver液葡萄糖2.05g柠檬酸钠0.80g,Nacl0.42g溶于100ml重蒸水8ml抗凝、固定作用生理盐水0.85%9ml等渗溶液GKN液NaCl8g、KCl0.4g、Na2HPO4·2H2O1.77gNa2HPO4、·H2O0.69g、葡萄糖2g、酚红0.01g.溶于1000ml重蒸水中4～5ml模拟细胞内环境，维持溶液PH值稳定，着色细胞50%PEG液取PEG(MW4000)放入刻度离心管中，在沸水浴中加热，使其熔化，待冷至50℃时，加入预热50℃等体积的GKN液，混匀即可。0.5ml用于诱导细胞融合注意事项:=1\*GB2⑴、胞融合对温度的敏感很高，过高和过低的温度都会严重影响细胞融合，其温度应该控制在37℃～39℃范围内。=2\*GB2⑵、EG有毒性，此次实验对PEG的浓度要求很高，实验时应该选用分子量在1500～6000PEG的浓度以50%为好。=3\*GB2⑶、PH是该验细胞融合成功的关键，所以这次实验所配制的试剂PH应控制在7.0～7.2。=4\*GB2⑷、在镜检观察时候应注意区别细胞融合与重叠的蟾蜍血红细胞。实验项目：细胞核的分离与鉴定实验原理：细胞内各种结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不同，用不同的转速和不同的介质离心，就可以将细胞内各组分分级分离出来。本实验就是利用了细胞核的比重大小与细胞内其他组分不同，先将组织制成匀浆，再在悬浮的均匀介质中进行离心，分离，甲苯胺蓝又可以将细胞核染成蓝紫色，这样，就可以鉴别分离出来的细胞核。预期结果：在显微镜下可见b切片中有蓝紫色颗粒为细胞核教师：日期：实验仪器、设备、器具表名称规格、型号数量说明显微镜普通光学显微镜1台用于镜检离心机普通离心机1台用于提取血细胞天平恒温水浴箱1台用于恒温水浴加热离心管50ml2支用于提取血细胞滴管胶头1支用于粗略取用液体载玻片2.5cm*7.5cm2张用于制作涂片盖玻片2cm*2cm2张用于制作涂片玻璃漏斗普通玻璃漏斗1个用于过滤量筒10ml1支用于量液烧杯25ml1个用于过滤解剖剪1只用于剪碎组织块镊子1只用于夹取组织块纱布8层用于过滤玻璃匀浆器1只用于研碎组织块染色盘1个用于染色实验试剂表名称规格用量说明蔗糖-CaCl2溶液0.25mol/L蔗糖0.003mol/LCaCl28ml供能、保护生理盐水0.85%9ml等渗溶液甲苯胺蓝1%1ml染色实验步骤：处死：断头处死小鼠，手提尾部使腹内血液尽量流出。取材：迅速开腹取肝，在盛有生理盐水的小烧杯中反复洗涤，取湿重约1g的肝脏组织放在烧杯中。匀浆：加入8ml预冷的0.25mol/L蔗糖-0.003mol/LCaCl2中溶液于烧杯中，尽量剪碎组织，再将剪碎的组织放入玻璃匀浆器中进行匀浆，匀浆器要处在低温环境中，直到看不到明显的组织块为止。过滤：用8层纱布（生理盐水或蔗糖溶液润湿的纱布）过滤匀浆液。离心：将过滤后的匀浆液转入离心管中，再在天平上平衡每对离心管，2500r/min离心15min，取上清液于另一离心管中。剩下的沉淀和上清液和沉淀制成悬液。涂片：取上清