医学遗传学实验：细胞与遗传实验手册

PAGE以疾病为主线的医学遗传学实验细胞分子遗传学实验手册编者：陈慧梅蒋爱芹凌立君南京大学医学院二○一四年五月

目录第一章细胞分子生物学常用仪器设备及操作 31.常用仪器设备…………...32.细胞培养实验室的设置及设备……………………...43.常用操作………………..10第二章细胞与分子生物学常用实验技术 …………..131.分子实验技术………….132.细胞实验技术………….13第三章细胞遗传学实验 14实验一考马斯亮蓝染色法显示细胞骨架………...14实验二台盼蓝染色及细胞计数实验……………….16实验三细胞的传代培养实验………..17实验四细胞的冻存与复苏实验……………………..19实验五PEG介导的细胞融合实验………………….21实验六肝细胞的原代分离及培养………………….23实验七MTT法检测细胞活力实验…………………25实验八涂片染色法观察骨髓自然凋亡细胞 ……..27实验九人类外周血染色体标本的制备……………29实验十G显带染色体标本制备与识别……………31第四章生化分子遗传学实验 …33实验一血清肌酸激酶活性测定……………………..33实验二血清铜蓝蛋白测定实验……………………..35实验三外周血细胞基因组DNA的提取(NaI法)………………37实验四碱裂解法提取质粒DNA…………39实验五聚合酶链式反应（绿色荧光蛋白基因的PCR扩增）……………….42实验六限制性内切酶消化实验…………………….'44实验七琼脂糖凝胶电泳实验……….’45实验八大肠杆菌感受态细胞的制备及转化………………47第五章临床群体遗传学实验…………………..50实验一PTC尝味实验…………………50实验二遗传咨询……………………….51

第一章细胞分子生物学常用仪器设备及操作1.常用仪器设备1.1测量设备固体的测量设备：各种量程、精度的电子天平等，用以称取一定质量的固体药品液体的测量设备：量筒、移液管、微量移液器等，用于量取一定体积的液体试剂。pH值的测量设备：pH试纸，pH计，直接测量溶液的pH值。光密度值的测量设备：分光光度计，通过OD值反映核酸、菌液等的浓度。1.2灭菌消毒及净化设备高压蒸汽灭菌器：常用于玻璃器皿、培养基、试剂等在使用前的灭菌和一些有潜在危险的细菌、病毒等在丢弃前的灭菌。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121干热灭菌烘箱：用于金属器械、瓷器和玻璃器皿（如剪刀、镊子、三角瓶和培养皿等）的干热灭菌，温度可达160℃除菌过滤器：用于不耐高温、高压的试剂灭菌（如抗生素、维生素或血清等）。常用滤膜孔径为0.22μm（能去除样品、流动相中极细颗粒的要求，可以达到GMP或者药典规定的除菌99.99%的要求）或0.45μm（能滤除大多数细菌微生物，降低细菌负荷；常规样品、流动相过滤，能够满足一般色谱要求）。紫外灯：用于无菌室和超净台等空气灭菌。超净工作台：原理是由鼓风机驱动空气，经过低、中效的过滤器后，通过工作台面，使实验操作区域成为无菌的环境。1.3温控及干燥设备冰箱及冷柜：用于试剂、酶、抗生素和菌种等的保藏。4℃合适贮存某些溶液、试剂、药品等。-20℃适用于某些试剂、药品、酶、血清、配好的抗生素和DNA、蛋白质样品等。-80℃液氮罐：用于长期储存细胞、病毒或某些微生物，或为实验提供液氮。培育箱：37℃恒温培育摇床：用于大肠杆菌等生物工程菌种的扩增。水浴锅：用于保温并进行各类试验。25-100℃水浴摇床可用于分子杂交试验，各种生物化学酶反响等试验的保温。含低温的水浴槽能够用于分子生物学的质粒与基因片段的衔接等试验及用于42烘箱：主用于烘干试验器皿，有些需求温度高些，有些需求温度低些。用于RNA方面的试验用具，需求在250℃烤箱中烘干，有些塑料用具只能在42-451.4电泳及检测设备电泳体系：电泳技能是检测、判定各种生物大分子的纯度、含量及描绘它们的特征，乃至仍是别离、纯化、收回和浓缩样品的东西之一。电泳体系分为电源和电泳槽，电源需经稳流经过稳压器，既能供给安稳的直流电，又能输出安稳的电压；水平式电泳槽：通常分为微型电泳槽和大号水平式电泳槽，通常用于核酸的电泳；垂直电泳槽通常用于蛋白质的电泳。凝胶成像系统：用于电泳后含溴化乙锭的核酸样品的观察分析。1.5显微镜普通光学显微镜：正置型及倒置型生物显微镜根据不同的应用需求。荧光显微镜：荧光就是某些物质在一定波长光(如紫外光)的照射下，在极短时间内所发出的比照射光波长更长的可见光。荧光显微镜结可发荧光的物质进行观测的一种实验技术。相差显微镜：相差显微镜能够改变直射光或衍射光的相位,并且利用光的衍射和干涉现象,把相差变成振幅差(明暗差)，同时它还吸收部分直射光线，以增大其明暗的反差，可用以观察活细胞或未染色标本。1.6其它设备超纯水机：用自来水、蒸馏水、离子交换水、反渗透纯水做为供水，磁铁耦合齿轮泵效果使水循环。用于PCR、PCR氨基酸剖析、DNA测序、酶反响、安排和细胞培育等。高速离心机：根据各种物质在质量、沉降系统等方面的差异，利用强大的离心力场，用于细胞和生物大分子等的分离、纯化和浓缩。按转速的不同，可分为普通离心机、高速离心机和超速离心机等，有冷冻和常温两种。PCR仪：PolymeraseChainReaction仪，也称DNA热循环仪，基因扩增仪，它是使一对寡核苷酸引物结合到正负DNA链上的靶序列两边，然后酶促组成拷贝数百万倍的靶序列DNA基因片段，它的每一循环包含在三种不一样温度进行的DNA变性，引物复性，DNA聚合酶催化的延伸反响三个进程。需求阐明的是，有些试验室能够还需求梯度PCR仪或实事定量荧光PCR仪来进行一些特别的分子生物学试验。1.7其他微波炉：便于一些溶液的疾速加热和定温加热，电泳琼脂糖凝胶制作、溶化等。制冰机：用于制作大多数核酸、蛋白质的试验操作所需的低温环境，以削减核酸酶或蛋白质酶的水解。磁力搅拌器：多角度旋转混匀器、疾速振动混合器：用于混合仪器。匀浆器：超声安排及细胞破碎器，用其进行样品的别离提纯试验。通风橱：许多溶剂能逸出毒气，必备柜，放射性试验还要有有机玻璃屏蔽。Tip头、Eppendorf管：微管移液器tip头（吸液尖）、Eppendorf管（微量离心管）可洗刷，硅化消毒后重复运用。对一些需求严厉的试验，如RNA的获取、保管等操作，应运用新的消毒tip头与Eppendorf管。别的还应备有常用标准的离心管（1000ml、500ml、250ml、50ml、7ml等）及96孔、24孔、12孔、6孔的细胞培育塑料平板等。小型设备、用具：定时器、滤膜、保鲜膜、防护眼镜鸭嘴镊、惯例的玻璃或塑料器皿（包含平皿、试管、烧杯、量瓶、试剂分液漏斗、避光保管的试剂应运用棕色试剂瓶，如饱满酚、巯基乙醇等、记号笔、各种手套PE、乳胶、家用、防酸的等）

2.细胞培养实验室的设置及设备2.1细胞培养实验室的设置细胞培养实验室应进行六方面的工作：无菌操作、孵育、制备、清洗、消毒灭菌处理、储藏。无菌操作区：无菌操作区只限于细胞培养及其他无菌操作的区域，最好能与外界隔离，不能穿行或受其他干扰。理想的无菌操作室应划为三部分：a)更衣室—―供更换衣服、鞋子及穿戴帽子和口罩。b)缓冲间—―位于更衣间与操作间之间，目的是为了保证操作间的无菌环境，同时可放置恒温培养箱及某些必需的小型仪器。c)无菌操作间—―专用于无菌操作、细胞培养。其大小要适当，且其顶部不宜过高（不超过2.5m）以保证紫外线的有效灭菌效果；墙壁光滑无死角以便清洁和消毒。无菌操作间的空气消毒：紫外线灯—－产生臭氧，并且室内温度及湿度均较高，不利于工作人员健康。空气过滤的恒温恒湿装置—－最好。净化工作台：操作简单，安装方便，占用空间小且净化效果很好。一般细菌培养室使用的净化工作台主要有两种：a)侧流式或称垂直式b)外流式或称水平层流式。净化工作台工作原理（大致相同）—－通常是将室内空气经粗过滤器初滤，由离心风机压入静压箱，再经高效空气过滤器精滤，由此送出的洁净气流以一定的均匀的断面风速通过无菌区，从而形成无尘无菌的高洁净度工作环境。侧流式工作台—－空气净化后的气流由左或右侧通过工作台面流向对侧，也有从上向下或从下向上流向对侧，形成气流屏障保持工作区无菌。工作台结构为封闭式。外流式（水平式）工作台—净化后的空气面向操作者流动，因而外方气流不致混入操作，但进行有害物质实验操作则对操作者不利。孵育区：本区对无菌的要求虽不比无菌区严格，但仍需清洁无尘，因此也应设置在干扰少而非来往穿行的区域。孵育可在孵箱或可控制温度的温室中进行。制备区：在该区主要进行培养液及有关培养用的液体等的制备。储藏区：主要存放各类冰箱、干燥箱、液氮罐、无菌培养液、培养瓶等，此环境也需要清洁无尘。清洗和消毒灭菌区：清洁和消毒灭菌区应与其他区域分开，主要进行所有细胞培养器皿的清洗、准备、消毒及三蒸水制备等工作。2.2细胞培养实验室的设备2.2.1常用的基本设备显微镜：倒置显微镜——是组织细胞培养室所必需的日常工作常规使用设备之一，便于掌握细胞的生长情况并观察有无污染等。若有条件，尚可配置带有照相系统的高质量相差显微镜、解剖显微镜、荧光显微镜、录像系统或缩时电影拍摄装置等，以便随时观察、记录、摄影细胞生长情况。CO2培养箱：能够提供进行细胞培养时所需要的一定量的CO2（常用浓度为5％），易于使培养液的pH保持稳定，适用于开放或半开放培养。培养细胞的器皿可用培养皿、培养板或培养瓶；当使用培养瓶时，可将瓶盖略微旋松，使培养瓶内与外界保持通气状态。由于这种培养方法培养器皿内部与外界相通，培养箱内空气必须保持清洁，应定期以紫外线照射或酒精消毒。同时培养箱应放置盛有无菌蒸馏水的水槽，防止培养液蒸发，使箱内相对湿度始终保持为100％。干燥箱：用于细胞培养箱的有些器械、器皿需要烘干后才能使用，玻璃器皿等须干热消毒。干热消毒时，电热干燥箱升温较高，一般需达到160℃以上。通常使用鼓风式电热干燥箱。其优点是温度均匀、效果较好，缺点是升温过程较慢。升温时不能先升温后鼓风而应鼓风与升温同时开始，至100℃时，停止鼓风，应避免包裹器皿的纸或棉花烧焦，烧焦的碎屑可影响细胞的生长。消毒后，不能立即打开箱门以免骤冷而导致玻璃器皿损坏，应等候温度自然下降至100℃以下方可开门。水纯化装置：细胞培养对水的质量要求较高，细胞培养以及与细胞培养工作相关的液体的配制用水必须事先严格纯化处理。水纯化时可采用离子交换装置或蒸馏器。离子交换纯水尚不能有效去除有机物，因此用水时尚需再次蒸馏。进行细胞培养时配制各种培养液及试剂等均需使用三次蒸馏水，即使是用于玻璃器皿的冲洗，也应使用二次以上蒸馏水。冰箱：细胞培养室必须配备。a）普通冰箱或冷藏柜：储存培养液、生理盐水、Hank’s液试剂等培养用的物品及短期保存组织标本。b）低温冰箱（-20℃）、超低温冰箱：储存需要冷冻保存生物活性及较长时期存放的制剂，如酶、血清等。细胞培养室的冰箱应属专用，不得存放易挥发、易燃烧等对细胞有害的物质，且应保持清洁。细胞冷冻储存器：储存器常用的是液氮容器。根据使用需要分为不同的类型及多种规格。选择购置液氮容器时要综合考虑容积大小，取放使用方便及液氮挥发量（经济）三种因素。液氮容器的大小可自25L～500L，可以储存1ml的安瓿250～15000个左右。液氮温度可低达-196℃，使用时应防止冻伤。由于液氮不断挥发，应注意观察存留液氮情况，及时定期补充液氮，避免挥发过多而致细胞受损。离心机：进行细胞培养时，常规需要进行制备细胞悬液、调整细胞密度、洗涤、收集细胞等工作，通常需要使用离心机。a）一般可常规配置4000rpm的国产台式离心机，例如细胞沉降，使用80～100g的离心机即可，离心力过大有时可能引起细胞的损伤。b)另外，可根据需要添置其他类型如大容量或可调节温度的离心机等。c）若需特殊用途，例如某些细胞的分离制备需梯度离心，另行配置实验所需的具备其他特殊功能的离心机。其它设备：a)消毒器：直接或间接与细胞接触的物品均需消毒灭菌处理。b）滤器：目前细胞培养工作中采用的培养用液，包括人工合成培养液、血清、消化用胰酶等常含有维生素、蛋白、多肽、生长因子等物质，这些物质在高温或射线照射下易发生变性或失去功能，因而上述液体多采用滤过消毒以除去细菌。2.2.2培养器皿：供细胞接种、生长等用的器皿，可由透明度好、无毒的中性硬质玻璃或无毒而透明光滑的特制塑料制成。a）玻璃培养器皿的优点是多数细胞均可生长，易于清洗、消毒，可反复使用，并且透明而便于观察；缺点是易碎，清洗时费人力。b）塑料制培养器皿的优点是一次性使用，厂家已消毒灭菌密封包装，打开即可用于细胞培养操作。常用的培养器皿：a)培养瓶：由玻璃或塑料制成。主要用于培养、繁殖细胞。进行培养时培养瓶瓶口加盖螺旋瓶盖或胶塞，胶塞多用于密封培养。国产培养瓶的规格以容量（ml）表示，如250ml、100ml、25ml等；进口培养瓶则多以底面积（cm2）表示。b)培养皿：由玻璃或塑料制成，供盛取、分离、处理组织或做细胞毒性、集落形成、单细胞分离、同位素掺入、细胞繁殖等实验使用。常用的培养皿规格有10cm、9cm、6cm、3.5cm等。c)多孔培养板：为塑料制品。可供细胞克隆及细胞毒性等各种检测实验使用。其优点是节约样本及试剂，可同时测试大量样本，易于进行无菌操作。培养板分为各种规格，常用的规格有：96孔、24孔、12孔、6孔、4孔等。各种单层生长的细胞在培养器皿中长满时可获得的细胞数，主要是取决于器皿的底表面积和细胞体积的大小。常用培养器皿及可获得的细胞数（以Hela细胞为例）见表2。表2常用的培养器皿及可获得的细胞数培养器皿底面（cm2）加培养液量（ml）可获细胞量96孔培养板0.320.11×10524孔培养板21.05×10512孔培养板4.52.01×1066孔培养板×1064孔培养板285.07×1063.5cm培养皿83.02.0×1066cm培养皿215.05.2×1069cm培养皿4910.012.2×10610cm培养皿5510.013.7×10625cm塑料培养瓶255.05×10675cm塑料培养瓶7515~302×10725ml玻璃培养瓶194.03×106100ml玻璃培养瓶37.510.06×106250ml玻璃培养瓶7815.07×1072500ml旋转培养瓶700100~2502.0×108培养操作有关的器皿：a)贮液瓶：主要用于存放或配制各种培养用液体如培养液、血清及试剂等。贮液瓶分为各种不同规格，如1000ml、500ml、250ml、100ml、50ml、5ml等。b)吸管：主要分为刻度吸管、无刻度吸管。刻度吸管主要用于吸取、转移液体，常用的有1ml、2ml、5ml、10ml等规格。无刻度吸管分为直头吸管及弯头吸管，除可以作吸取、转移液体外，弯头尖吸管还常用于吹打、混匀及传代细胞。c)加样器（移液器）：用于吸取、移动液体或滴加样本。可根据需要调节量的大小，吸量准确、方便。尤以微量加样器，可保证实验样品（或试剂）含量精确，重复性良好。c）其他用品：尚有收集细胞用的离心管，放置试剂或临时插置吸管用的试管，装放吸管以便消毒的玻璃或不锈钢容器，用于存放小件培养物品便于高压消毒的铝制饭盒或贮槽，套于吸管顶部的橡胶吸头，封闭各种瓶、管的胶塞、盖子、冻存细胞用的安瓿或冻存管、不同规格的注射器、烧杯和量筒以及漏斗，超净工作台使用的酒精灯，供实验人员操作前清洁消毒手使用的盛有酒精或其他消毒液的微型喷壶等。2.2.3器械：主要用于解剖、取材、剪切组织及操作时持取物件。常用的有：手术刀或解剖刀、手术剪或解剖剪（弯剪及直剪），用于解剖动物、分离及切剪组织，制备原代培养的材料；眼科虹膜小剪（弯剪或直剪），用于将组织材料剪成小块；血管钳及组织镊、眼科镊（弯、直），用于持取无菌物品（如小盖玻片）夹持组织等；口腔科探针或代用品，用以放置原代培养之组织小块。3.常用操作3.1可调式移液器的使用手柄盖操作按钮手柄盖操作按钮显示窗管嘴推出器手柄管嘴推出环管管嘴圆锥操作杆1、正确拿法：将移液器的把手朝外，四指并列放于把手下方，用拇指按住移液器按钮。2、量程调节：将旋钮调至所需刻度处，注意不可超出最大量程。3、安装吸头：将吸头放在吸头盒中，将移液器的前部插入吸头中，用力插两下，拿出即可。4、预洗吸头：新装吸头或增加容量后，首先应该把需要转移的液体吸取、排放两三次，使吸头内壁形成一道同质液膜，提前移液工作的精准度，使整个移液过程具有极高的重现性。5、取液：按下按钮到第一停点（推动按钮内部的活塞分2段行程，第一档为吸液，第二档为放液，手感十分清楚）。将管嘴没入液面下2-3mm（浸入过深，液压会对吸液的精确度产生一定的影响），轻缓松开按钮回到开始位置。仔细提上管嘴并在容器壁上停靠一下，以去除多余液体。6、放液：轻按按钮至第一停点，液体即被排出；稍停片刻继续按按钮至第二停点（即吹出），这一步骤将排空管嘴，保证液体准确转移。若还有残留液体的话，需要更换吸头或移液器。7、反向移液：使用该技术将吸入多于设置量程的液体，而移液不用吹出功能，这样多余液体仍留在管嘴中。在转移高粘度液体、生物活性液体、易起泡液体或极微量液体时建议使用该技术。3.2pH试纸检测溶液1）用滴管吸取待测液，滴在pH试纸上（可将整条试纸剪成小片），并在半分钟内与比色卡比较，读出pH；2）用玻璃棒取待测液，涂在pH试纸上，并在半分钟内与比色卡比较，读出pH；切忌不要将pH试纸浸入待测液，因为试纸浸入待测液会有指示剂流失，从而导致所测值不准，而指示剂流失的同时，会污染待测液。3.3核酸浓度检测DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，其吸收峰在260nm处。波长为260nm时，DNA或RNA的光密度OD260不仅与总含量有关，也随构型而有差异。对标准样品来说，浓度为1μg/ml时，DNA钠盐的OD260＝0.02；当OD260＝1时，dsDNA浓度约为50μg/ml；ssDNA浓度约为37μg/ml；RNA浓度约为40μg/ml；寡核苷酸浓度约为30μg/ml（底物不同有差异）当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响DNA吸光度的准确测定。一般情况下同时检测同一样品的OD260和OD280，计算其比值来衡量样品的纯度。经验值：纯DNA：OD260/OD280≈1.8(＞1.9,表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白质、酚等污染）；纯RNA：1.7＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫氰酸残存）。若样品不纯，则比值发生变化，此时无法用分光光度法对核酸进行定量。3.4电泳原理：生物大分子（如蛋白质，核酸，多糖等）大多都有阳离子和阴离子基团,称为两性离子。常以颗粒分散在溶液中，它们的静电荷取决于介质的H+浓度或与其他大分子的相互作用。在电场中,带电颗粒向阴极或阳极迁移，迁移的方向取决于它们带电的符号,这种迁移现象即所谓电泳。电泳的样品支持物，生物实验大多为凝胶。水平电泳：用琼脂糖凝胶作支持物的电泳法。借助琼脂糖凝胶的分子筛作用，核酸片段因其分子量或分子形状不同，电泳移动速度有差异而分离。是基因操作中常用的重要方法。垂直电泳：用于分离蛋白质和寡糖核苷酸。聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶及SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS）；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。转移电泳：将混杂的蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移至固相膜上，再用标记的抗体或二抗与之反应，以显示膜上特定的蛋白条带。

第二章细胞与分子生物学常用实验技术1.分子实验技术核酸的凝胶电泳；聚合酶链反应技术实时定量PCR重组DNA技术RNA基本操作技术核酸杂交探针蛋白质电泳技术蛋白质印迹技术原位杂交技术SNP的理论与应用基因突变与敲除2.细胞实验技术普通光学显微镜使用技术荧光显微镜使用技术细胞流式仪分析技术细胞培养技术细胞器染色技术细胞活性测定技术细胞凋亡检测技术细胞融合技术细胞染色体分离与显带技术

第三章细胞遗传学实验实验一考马斯亮蓝染色法显示细胞骨架【实验目的】了解细胞骨架的结构特征及制备技术【实验原理】细胞骨架是真核细胞中由蛋白质聚合而成的三维网架体系。细胞骨架可以分为微管、微丝和中间纤维三大类，它们都是由各自的蛋白质聚合而成的蛋白质纤维状结构，在细胞中组织成特定的排列方式，以执行特定的功能。用非离子型表面活性剂TritonX-100处理细胞，可以溶解膜脂，并与大部分非骨架蛋白疏水区结合而将其溶解掉，剩下细胞骨架系统的蛋白不被溶解，然后用蛋白染料考马斯亮蓝染色即可显示骨架结构。【实验用品和材料】1.材料：体外培养的贴壁生长细胞2.试剂：（1）M缓冲液，配方为：咪唑50mmol/L；KCl50mmol/L；MgCl20.5mmol/L；EGTA1mmol/L；EDTA0.1mmol/L；巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）1mmol/L；用1mol/L盐酸调pH至7.2（2）6mmol/L（pH6.8）磷酸缓冲液，用NaHCO3调其pH。（3）1%TritonX-100：用M缓冲液配。（4）固定液：3%戊二醛，用M缓冲液配。（5）0.2%的考马斯亮蓝R250染液。其溶剂为：乙醇46.5mL；冰醋酸7mL；蒸馏水46.5mL3.用品：显微镜；1.5mLeppendorf管、盖玻片【操作步骤】1.将细胞培养在盖玻片上。取出盖玻片，用PBS洗3次。2.室温下用1%TritonX-100处理20～30min。3.用M缓冲液轻轻洗细胞3次。4.用3.0%戊二醛固定细胞10min。5.用PBS洗三次，滤纸吸干。6.用0.2%考马斯亮蓝R250染色30min。蒸馏水冲洗，在空气中自然晾干。7.在光学显微镜下观察，可看到细胞骨架主要沿着细胞生长长轴成极性分布。【作业与思考题】1.考马斯亮蓝染色法显示的细胞骨架能区分微丝、微管和中间纤维吗？为什么？2.查阅资料说明M缓冲液各组分成分的作用。实验二台盼蓝染色及细胞计数实验【实验目的】掌握用台盼蓝染色法区分细胞死活的技术；掌握用血球计数板进行细胞计数的方法【实验原理】活细胞的细胞膜完整，不允许台盼蓝等水溶性染料进入细胞内；死细胞膜的完整性受到破坏，允许这些染料进入细胞，据此可以用台盼蓝等染料染色鉴定细胞死活。【实验用品和材料】1.材料：研磨组织产生的细胞、抗癌物质处理过的癌细胞或沸水处理5min的细胞。2.试剂：0.4%的台盼蓝生理盐水溶液：称取0.4g台盼蓝染料，加少量水研磨粉碎；再加水至50mL，过滤；加入等量1.83.用品：1.5mL塑料离心管、胶头吸管、显微镜等。【操作步骤】1.待检细胞悬液与等体积的台盼蓝染液混合染色3~5min。2.制备装片观察死活细胞，并用计数板计数活细胞比率。死细胞染成蓝色，灰暗、无折光性，细胞变大；活细胞不着色、折光强、大小正常。活细胞比率=（细胞总数-蓝染色细胞）/细胞总数×100%【注意事项】1.台盼蓝染料对细胞有一定毒性，染色时间不可过长，否则会导致死细胞比率增大。如果同时检测多个细胞样品，应逐一加染液染色、计数，而不要一次性将多个细胞样品同时加染液染色后再处理，否则后面检查的细胞样品得到的活细胞比率会比实际低。2.检验活细胞时要尽可能快，以免计数板上的细胞脱水而死。【作业与思考题】除了台盼蓝染液，还有那些染液可用于细胞死活鉴定？实验三细胞的传代培养实验【实验目的】了解体外细胞传代培养的方法及技术，观察体外细胞的形态及生长情况。【实验原理】一些血清蛋白和培养细胞的膜表面黏附蛋白参与了细胞与细胞之间及细胞与培养瓶、器皿壁的黏附，使细胞贴壁生长及互相连接成片。用胰蛋白酶分解这些蛋白可以使细胞间连接断裂，细胞与培养瓶、皿底部分开。【实验用品和材料】1.材料：融合度达到80%~90%的贴壁生长HeLa细胞。2.试剂：DMEM基础培养液；DMEM完全培养液（DMEM基础培养液90%，小牛血清10%，青霉素100IU/mL，链霉素100μg/mL）3.用品：超净工作台、纯水仪、电热干燥箱、高压蒸汽消毒锅、过滤器及0.22μm滤膜、CO2培养箱、冰箱、液氮罐、倒置显微镜、天平、离心机、水浴锅、培养瓶或培养皿、细胞计数板等。【操作步骤】1.清洗除培养液及死亡细胞：先倒掉原有的培养液，用D-Hanks清洗液培养物2次，以尽量去除培养液中的血清成分和死亡细胞。2.酶消化：加入2~3mL，含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液、轻轻摆动数次使胰蛋白酶溶液与细胞充分接触后，吸出大部分胰蛋白酶，仅留下约0.5mL在培养瓶里；置培养瓶于倒置显微镜下监测消化情况，待细胞突起缩回、细胞之间间隙增大、细胞近乎缩成圆球形时即可。这个过程大概需要1~3min。3.终止消化：当确认消化完全时，加入5mL新鲜的完全培养液终止消化。4.收集细胞：用吸管吸取培养瓶、皿中的培养液，有次序地冲洗整个瓶、皿底部，使90%以上的细胞与培养容器底部脱离，并充分分散（成团细胞生长不良）。但吹打动作不宜过猛，吹出液体力度适中，并避免产生气泡，否则会损伤细胞。5.分割培养：视细胞的多少，分别接种在2~3个培养瓶中，加足培养液继续培养。一般按1:2或1:3接种（即一个培养瓶、皿中消化下来的细胞接种于2个或3个同样大小的培养瓶、皿中）。【注意事项】消化过度会损伤细胞，使其不能再次贴壁生长；消化不足则导致细胞难以从瓶壁上吹下，反复吹打同样会损伤细胞。【作业与思考题】1.用酶消化细胞之前为什么用D-Hanks液清洗培养物而终止消化又是用完全培养液？2.对一种新的细胞株传代时怎样把握消化程度？实验四细胞的冻存与复苏实验【实验目的】了解和掌握细胞冻存与复苏的方法，能独立完成细胞的冻存和复苏。【实验原理】在低于-70℃细胞冻存与复苏的原则是“慢冻快融”，这样可以使细胞较好的存活。温度由-1℃、-25℃、-80℃之后放入液氮内（-196℃）。冻存时为了减少冰晶对细胞的损伤，常常加入5%～15%的甘油或二甲亚砜（DMSO）。这两种物质在低温下对细胞没有明显毒性，而且分子小，溶解度大，易于穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性；加上缓慢冷冻方法可使细胞内的水分渗透到细胞外，在细胞外形成冰晶，减少细胞内冰晶的形成，从而减少形成冰晶所造成的细胞损伤。复苏时把装有细胞的冻存管直接放入37【实验用品和材料】1.材料：融合度达到80%~90%的贴壁生长HeLa细胞。2.试剂：（1）含20%小牛血清的培养液（2）冻存保护液（3）DMSO或甘油3.用品：普通冰箱、-30℃低温冰箱、-80℃【操作步骤】细胞冻存实验1.收集细胞：取2支eppendorf管，各加入1mL浓度约为5×106个/mL的细胞悬液，1500r/min离心8min，弃上清液。2.分别用1mL培养液和冻存保护液重悬细胞，转入经检查无破裂的冻存管中。3.封口。一般用Parafilm封口膜，撕开缠绕几圈。写标签。4.冻存。4℃冰箱20~30min；-20℃低温冰箱30min~1h；-80℃ 也可用20层纱布包裹或放入厚壁泡沫盒中，直接置于-80℃冰箱中冻存24h再投入液氮中。学生实验用-80细胞复苏实验1.复温。从液氮中取出冻存管，立即在37℃温水中快速晃动1~2min，2.吸取冻存保护液。将细胞冻存悬液移入带盖离心管中；加入约5mL培养液，轻轻吹打混匀；1000r/min离心5min，弃去上清液。3.检查细胞活率。用1mL培养液重悬细胞，台盼蓝染料排除法检查细胞存活率。【作业与思考题】1.比较不加冷冻保护剂和加两种不同冷冻保护剂（甘油和DMSO）冻存后的细胞存活率。2.查阅资料了解冷冻保存时细胞浓度对冻存效果有无影响。3.细胞冻存时对冷冻管容量有什么要求？实验五PEG介导的细胞融合实验【实验目的】了解PEG诱导细胞融合的基本原理，初步掌握细胞融合技术。【实验原理】细胞融合是指两个或多个细胞通过质膜融合形成单个双核或多核细胞的现象，结果产生杂交细胞。亲本相同的融合细胞称为同核体，反之称为异核体。20世纪60年代首次体外人工诱导细胞融合获得成功以来，由于其应用的广泛性和广阔前景，已逐步发展成为重要的细胞工程技术。人工诱导细胞融合主要包括：病毒和化学融合剂及电融合和激光融合等方法。细胞融合能把亲缘关系较远，甚至毫无亲缘关系的生物体细胞融合在一起，为远缘杂交架起了桥梁，是改造细胞遗传物质的有力手段。它的意义在于从此打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造新种的界限，扩大了遗传物质的重组范围。PEG是乙二醇的多聚物，存在不同分子质量的多聚体，它可改变各类细胞的膜结构，使两细胞相互接触部位的膜脂双层中脂类分子发生疏散和重组，此时相互接触的两细胞的胞质沟通成为可能，从而使细胞之间发生融合。PEG介导细胞融合，其融合效果受到以下因素影响：分子质量及浓度、pH、处理时间和温度等。【实验用品和材料】1.材料（1）2%鸡红细胞悬液（2）5%小鼠腹水瘤细胞悬液2.试剂（1）50%PEG：称取5g相对分子质量1000的PEG，倒入带盖离心管中，沸水浴使PEG融化；将装有熔化PEG的离心管转入50℃水浴中，向管中加入5mL预热至50℃的GKN液，立即用粗口吸管吹打混匀，然后用NaHCO3调pH至8.0，保存于（2）GKN液：NaCl8g，KCl0.4g，Na2HPO4·12H2O3.558g，NaH2PO4·H2O0.78g，葡萄糖2g，酚红0.01g（可加可不加），加双蒸水至1000mL。3.用品离心机、水浴锅、细胞计数板、离心管、离心机等。【操作步骤】1.吸取材料中的细胞悬液1ml（单独一种或两种混合），1000r/min离心5min，弃大部分上清液，约留0.1mL液体；或者弃去全部上清液。2.有手指轻弹离心管底部，使沉淀松散，然后将离心管放入37℃水浴中；吸取预热至37℃的50%PEG0.5m3.终止PEG作用：加入8mL预热至37℃4.除融合剂：1500r/min离心5min，弃去上清液；用1mlGKN液重悬细胞。制备装片，显微镜观察融合现象；计数200个细胞，计算细胞融合率（融合细胞核数占细胞核总数的百分率）。融合细胞判断：已初步融合的两个细胞接触处的细胞膜破坏，胞质贯通。融合细胞核数融合细胞核数+未融合细胞核数【注意事项】1.防止PEG因降温而凝固。加PEG时不要将装有细胞的离心管和装有PEG的离心管拿离水浴锅。2.50%PEG处理时间不宜过长，否则会导致细胞破坏或有多个细胞彼此融合形成巨大的合胞体。3.经PEG处理后加液混匀时应轻轻吹打，以免刚刚融合的细胞分开。【作业与思考题】1.多大相对分子质量的PEG用于细胞融合较为合适？2.PEG介导细胞融合的理想融合率是多少？怎样提高PEG介导的细胞融合率？实验六肝细胞的原代分离及培养【实验目的】通过直接消化法分离小鼠肝细胞进行原代培养，从而得到体外培养的小鼠肝细胞，进行相关实验研究。【实验原理】肝脏作为机体重要的代谢器官，在多种生理病理过程中发挥重要作用。原代培养的肝细胞广泛用于药理学、毒理学、免疫学、分子生物学、细胞生物学等相关的研究，尤其在药物研发方面，使用原代肝细胞可较经济和迅速地阐明药物对药物代谢酶的诱导或抑制作用，从而避免采用大量动物进行药理效应筛选。但原代肝细胞增殖能力差，不易长时间保存或长期培养，建立简单易行的分离培养纯化肝细胞的方法显得十分重要。

体外培养肝细胞的关键是如何分离得到形态完整、体外代谢活性高的肝细胞。分离肝细胞方法主要分为非灌流的方法和灌流的方法。酶消化法包括胰酶消化和胶原酶消化。胰酶消化法是利用胰酶来破坏肝细胞之间的桥连,使肝细胞分离的一种方法。【实验用品和材料】1.器具：中号烧杯，平皿，小镊子，大镊子，小剪子，血球计数板，手套，试管架、酒精喷壶，离心管（15/50mL），吸管、100目孔径滤网、1mL移液器及Tip头、研磨玻片2.试剂：胰酶、PBS缓冲液、台盼兰、75%酒精【操作步骤】1.将小鼠断颈致死，置75%酒精烧杯泡2-3分钟，取肝脏，置于盛有PBS的平皿中。2.剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物，转移到另一个盛有PBS液的平皿中。3.用手术剪将脏器剪成小块（～1mm3），玻片研磨后，转到离心管，离心1000rpm，5min。4.视组织或细胞量加入5-6倍（3-5mL）胰酶，37℃中消化20分钟，每隔5min振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。6.加PBS至50mL，用100目孔径滤网滤过，除去未消化的大组织块。7.1000rpm，离心5min，弃上清液。8.加入红细胞裂解液（Tris-NH4Cl）5mL，冲散细胞，约2min，裂解红细胞9.加入PBS至15mL，再离心一次，弃上清液。10.加入PBSl-2mL（视细胞量），血球计数板计数。11.台盼兰染色，计数活细胞数量及比率，调节活细胞浓度至106/mL。【作业与思考题】1.简述采用灌流方法分离肝细胞的技术有哪些？实验七MTT法检测细胞活力实验【实验目的】掌握利用MTT检测细胞活力和增殖程度的方法。【实验原理】MTT能被各种活细胞（哺乳动物红细胞）摄取，在线粒体内被脱氢酶还原，由黄色可溶性溶液转变为不可溶性的蓝紫色甲臜颗粒，用一定的裂解液裂解细胞并溶解甲臜，再通过测定溶液的光吸收值就可以推测活细胞的存活情况和增殖程度。【实验用品和材料】1.材料：肿瘤细胞2.试剂（1）RPMI1640培养液；（2）0.01mol/L,pH7.4的PBS缓冲液（磷酸二氢钠NaH2PO4·2H2O0.45g；Na2HPO4·12H2O3.227g；氯化钠8g；蒸馏水1000mL）（3）5mg/mL的MTT：用0.01mol/L,pH7.4的PBS缓冲液配制，溶解后用0.22μm滤膜过滤消毒，4℃（4）细胞裂解液：10%SDS-0.01mol/LHCl、DMSO或0.04mol/LHCl-异丙醇。3.仪器及用品CO2培养箱、96孔培养板、100ul枪及枪头、酶标仪、血球计数板等。【操作步骤】1.将培养至对数期的细胞先用RPMI1640培养液调浓度为8×106个/mL和8×105个/mL，然后分别进行倍比稀释，配成浓度为8×106个/mL、4×106个/mL、2×106个/mL、1×106个/mL、0.5×106个/mL和8×105个/mL、4×105个/mL、2×105个/mL、1×105个/mL、0.5×105个/mL两个系列。2.将不同浓度的细胞悬液分别加入96孔培养板，每孔加入100uL，每浓度3个重复孔。3.每孔加入MTT溶液10uL，混匀后在37℃，5%CO2培养箱培养44.置酶标仪570nm处测定OD值。5.以密度为横坐标，MTT法测定的OD值为纵坐标标绘出两条曲线，观察MTT值与细胞密度之间的关系。【注意事项】1.甲臜应完全溶解2.加入盐酸异丙醇后要在1h内进行测定。若1h内不能测定，可将未加盐酸异丙醇的96孔培养板放在4℃【作业与思考题】1.细胞浓度与MTT测定值之间的关系如何？2.影响MTT法检测结果可靠性的主要因素有哪些?

实验八涂片染色法观察骨髓自然凋亡细胞【实验目的】掌握利用常规染色法，观察骨髓细胞的凋亡情况【实验原理】骨髓中造血干细胞发育为血细胞过程中有部分细胞会发生凋亡。细胞在凋亡过程中会发生一系列变化，如形态变化、DNA有规律的断裂、膜表面物质组成发生变化等。凋亡细胞的形态学变化主要体现在细胞核，首先出现染色质凝结于中央异染色质区域或核膜下，形成浓缩的染色质块，嗜碱性染色增强；随着染色质不断凝聚，核膜在核孔处断裂形成碎片，散布于细胞中；最后细胞核裂解为碎块，核碎片和部分细胞质由膜包被形成凋亡小体（程序死亡小体），从细胞表面出芽脱落。核的这些变化用普通染核染料或能与DNA结合的荧光染料都可以显示出来。【实验用品和材料】1.材料：小白鼠2.试剂（1）生理盐水：0.9%氯化钠；（2）甲醇；（3）0.067mol/L的PBS：Na2HPO4·12H2O11.81g；KH2PO44.5g，蒸馏水溶解并定容至1000mL。(4)吉姆萨染液储存液：取0.5g吉姆萨粉末，加33mL纯甘油，在研钵中研细；放在56℃恒温水浴中保温90min；再加入33mL（5）吉姆萨染液应用液：用0.067mol/L的PBS将储存液作1:20稀释。3.用品：普通光学显微镜、离心机、剪刀、注射器及针头、10mL离心管、胶头滴管、载玻片等。【操作步骤】1.骨髓细胞的收集：颈椎脱臼法处死正常小白鼠：去除前、后腿部肌肉，从关节处卸下长骨；剪掉长骨两端，用注射器吸取生理盐水将骨髓腔内细胞冲至离心管中；细胞悬液经1000r/min离心8min，弃去大部分上清液，留少许上清液（约相当于细胞沉淀的体积）重悬细胞。2.制备细胞悬液涂片：用胶头滴管加1小滴（约10μL）细胞悬液于载玻片长轴一端离边缘约1cm处中央。将有样品的载玻片A放在实验台平坦之处，右手持另一张载玻片B作为推片。先用一侧短边边缘接触细胞前沿，待细胞沿载玻片B边缘展开成线后，使载玻片B以与载玻片A呈30～45度角向前匀速移动，将细胞推成厚薄适宜的细胞涂片。将推好的细胞涂片在空气中晃动，使其迅速干燥。3.固定：给载玻片上的细胞标本处滴加甲醇，固定3min，若到时甲醇未干，可用吸水纸吸干。4.染色：用吉姆萨染液应用液或在载玻片染色盒内染色20～30min，流水冲去浮液，晾干标本。5.结果观察：正常细胞细胞核质均匀，染成淡蓝紫色；凋亡细胞染色质凝集（深染）、边缘化（靠近核膜）或有蓝紫色凋亡小体出现在细胞外。【作业与思考题】1.除了形态观察还有什么方法可用于检测细胞凋亡？实验九人类外周血染色体标本的制备【实验目的】学习外周血淋巴细胞悬浮培养的原理和方法，利用培养后进行分裂的细胞制备人类染色体标本。了解人类染色体的基本形态特点，为核型分析和原位杂交实验提供良好的染色体标本。【实验原理】染色体作为细胞遗传信息的载体，出现于有丝分裂期。用于人类染色体标本制备的材料可为外周血淋巴细胞、骨髓细胞、绒毛细胞或羊水细胞等。外周血中的淋巴细胞几乎都处于G0期或G1期，一般情况下是不分裂的。但是加入植物血凝素时，小淋巴细胞受刺激转化为淋巴母细胞，并开始进行有丝分裂。经短期培养后，用秋水仙素处理、低渗、固定、滴片和染色，就可获得大量中期分裂相的细胞进行核型观察。核型是指一个体细胞有丝分裂中期的所有染色体，并按其大小、形态特征顺序排列所构成的图像。每一个体细胞含有两组染色体，用2n表示。染色体核型分析是细胞遗传学的重要研究手段。在人类遗传分析中普遍采用外周血培养的方法获取分裂相细胞，进而开展临床和基础遗传学的研究，这对于遗传疾病的检出以及遗传咨询等工作发挥重要作用。【实验用品和材料】1.器具：隔水式恒温培养箱，恒温水浴箱，离心机，显微镜，刻度离心管、吸管、试管架，载玻片等。2.试剂：抗凝人外周血（淋巴细胞），培养液（可直接购制），仙水秋素（10μg/mL），0.075mol/LKCL低渗液，磷酸缓冲液（pH6.8），甲醇、冰醋酸、吉姆萨（Giemsa）原液【操作步骤】1.用一次性注射器抽取抗凝血1mL，将针头插入RPMI1640培养瓶内，每瓶滴入24-28滴血，摇匀。置37℃2.在终止培养前2-3小时，加入秋水仙素，终浓度0.2μg/mL，轻轻摇匀，放回培养箱中继续培养。3.将培养物倒入刻度离心管内，以1000r/min离心10分钟，弃去上清液，留底层沉淀物。4.加入37℃预温的0.075mol/LKCL低渗液8mL，用吸管混合均匀，置375.加入1mL新配制的固定液（甲醇：冰醋酸＝3：1），轻轻混合均匀，1000r/min离心6分钟，弃去上清液。6.加入8mL新配制的固定液（甲醇：冰醋酸＝3：1），轻轻吹打细胞团制成细胞悬液后，室温下固定30min，1500r/min离心6分钟，弃去上清液。7.根据细胞数量的多少适当加入0.2-0.4mL新配制的固定剂，轻度吹打细胞制成悬液。8.吸取少量细胞悬液，尽量高距离地滴2-3滴于冰水浸泡过的载玻片上，吹散，气干。9.取3滴吉姆萨原液加10滴磷酸缓冲液，温匀后滴在玻片标本上，染色6-8min。流水轻轻冲洗玻片背面，将染液冲掉；气干。10.显微镜高倍镜和油镜下观察染色体标本分裂相的多少及分散情况。【注意事项】秋水仙素的用量和作用时间、低渗和固定的处理。其中低渗处理很重要，处理时间很重要，处理时间过长则细胞膜过早破裂导致染色体丢失，处理时间不足则致染色体分散不好，不利于计数分析。【作业与思考题】1.简述人类染色体制备的操作过程和基本原理2.总结人类染色体制备过程中的关键步骤及注意事项实验十【实验目的】掌握胰酶法G显带的技术；掌握G显带核型分析的基本过程和技术。【实验原理】人们将用各种不同的方法，以及用不同的染料处理染色体标本后，使每条染色体上出现明暗相间，或深浅不同带纹的技术称为显带技术。本世纪70年代以来，显带技术得到了很大发展，且在众多的显带技术中（Q带、G带、C带、R带、T带），G带是目前被广泛应用的一种带型。因为它主要是经蛋白酶处理被Giemsa染料染色后而显带，故称之为G显带技术，其所显示的带纹分布在整个染色体上。每条染色体都有其较为恒定的带纹特征，所以G显带后，可以较为准确的识别每条染色体，并可发现染色体上较细微的结构畸变。G显带因其方法简便，重复性好，带纹清晰且可长期保存而应用最广泛。G显带的机理，目前有多种说法。例如，Lee等（1973）认为染色体上与DNA结合疏松的组蛋白易被胰蛋白酶分解掉，染色后这些区段成为浅带，而那些组蛋白和DNA结合牢固的区段可被染成深带。有人认为，染色体显带现象是染色体本身存在着带的结构。比如用相差显微镜观察未染色的染色体时，就能直接观察到带的存在。用特殊方法处理后，再用染料染色，则带更加清楚，随显带方法不同，显出来的带特点也不一样，说明带的出现又与染料特异结合有关。一般认为，易着色的阳性带为含有AT多的染色体节段，相反，含GC多的染色体段则不易着色。总的来说，G显带的机理还未搞清。【实验用品和材料】1.器具：显微镜、恒温培养箱、烤箱、恒温水浴箱、冰箱、染色缸等。2.材料：中期人类染色体标本、0.25％的胰蛋白酶工作液、生理盐水、Giemsa原液、Giemsa工作液、1mol/L磷酸缓冲液(pH4.0～4.5)。【操作步骤】1.将常规制备的人染色体玻片标本(未染色的白片)置于37℃烤箱中处理2h，然后转入372.取0.25％胰酶溶液5mL，倒入染色缸中，加入45mL生理盐水lmol/LNaOH及酚红调节胰酶溶液成肉汤色(pH6.8～7.2)。3、将配好的胰蛋白酶工作液放人37℃4、将玻片标本浸入胰蛋白酶液中，不断摆动使胰蛋白酶的作用均匀，处理4~5min(精确的时间自行摸索)。5.立即取出玻片，放人生理盐水中漂洗两次。6.将标本浸入37℃7.自来水冲洗(用细水小心冲洗)，空气干燥。8.镜检显带效果。在低倍镜下选择分散良好的长度适中的分裂相，转换油镜观察，若染色体未出现带纹，则为显带不足；若染色体边缘发毛为显带过头，此时应根据具体情况增减胰蛋白酶处理时间重新处理一张标本。【注意事项】G显带过程中的关键因素包括胰蛋白酶的作用时间、pH和温度等。其中胰蛋白酶溶液应37℃【作业与思考题】1.制作人的G显带正常核型配对分析图附：人类染色体G显带特征口诀一秃二蛇三蝶飘，四鞭炮五黑腰；六号是个小白脸，七上八下九苗条；十号长臂近带好，十一低来十二高；十三四十五，下中上；十六q2缢痕大，十七长臂带脚镣；十八人小肚皮大，十九一点腰；二十头重又脚轻，二十一像个葫芦瓢；二十二头戴小黑帽，X一担挑，Y是黑脚

第四章生化分子遗传学实验实验一血清肌酸激酶活性测定【实验目的】掌握酶活性测定的基本原理，了解血清肌酸激酶活性测定的原理和方法。【实验原理】肌酸激酶（creatinekinase，CK，EC）能可逆地催化磷酸肌酸和ADP生成肌酸和ATP。肌酸与双乙酰及α-萘酚结合生成红色化合物。在一定的范围内，红色的深浅与肌酸量成正比，进而可求得血清中CK活性。在反应体系中加入Mg2＋作激活剂；半胱氨酸供给巯基，保持CK活性中心必需基团不被氧化；氢氧化钡和硫酸锌沉淀蛋白并终止反应。磷酸肌酸＋ADPCK肌酸＋ATP肌酸＋双乙酰＋α-萘酚Mg红色化合物【试剂】1.Tris-HCl缓冲液（pH7.4）称取Tris2.42g，溶于蒸馏水100ml中，加入0.2mol/L盐酸88.8ml，无水硫酸镁0.34g，调pH至7.4，室温中可保存数月。2.0.012mol/L磷酸肌酸溶液称取磷酸肌酸钠盐43.6mg，加蒸馏水溶解至10ml，保存于3.0.004mol/LADP溶液称取ADP钠盐23.3mg，加蒸馏水溶解至10ml，保存于4.混合底物溶液临用前将试剂（1）、（2）、（3）等量混合，在此混合底物溶液9ml中，加入盐酸半胱氨酸31.5mg，调pH至7.4，置-20℃5.2.50g/L硫酸锌溶液准确称取ZnSO4·7H26.3.60g氢氧化钡溶液称取氢氧化钡[Ba（OH）2·8H2O]6g，溶于蒸馏水90ml中，煮沸数分钟，冷却后加蒸馏水至100ml，过滤。取50g/L硫酸锌溶液5ml，加少量蒸馏水和酚酞指示剂2滴，用氢氧化钡溶液滴定至粉红色。根据滴定结果，用蒸馏水稀释氢氧化钡溶液溶液，使其恰好与等体积的硫酸锌溶液中和。7.贮存碱溶液称取氢氧化钠30g，无水碳酸钠64g，加蒸馏水溶解，并稀释至500ml，置塑料瓶保存。8.α-萘酚溶液α-萘酚400mg加贮存碱溶液10ml，须新鲜配制，否则空白管吸光度增高。9.双乙酰溶液先配成10g/L水溶液，置冰箱保存，临用前用蒸馏水作20倍稀释。10.1.7mmol/L肌酸标准液称取无水肌酸22.3mg，加蒸馏水定容至100ml【操作步骤】【参考范围】惯用单位0.5～3.6U/ml；国际单位8～60U/L。【作业与思考题】1.实验报告内容：将测定的结果和计算结果填写至实验报告上，分析结果，得出结论。2.血清肌酐激酶活性测定的临床意义。3.通过酶活检测而诊断的遗传代谢病还有哪些？列出一个，结合遗传与临床特征加以分析。实验二血清铜蓝蛋白测定实验【实验目的】掌握蛋白测定的基本原理，了解血清铜蓝蛋白测定的原理和方法。【实验原理】铜蓝蛋白(ceruloplasmin，CP)是存在于血清、肝、肾中含铜的α2-糖蛋白，每个CP分子含有6～8个铜原子，其中Cu2+、Cu+各占一半，故呈蓝色。CP具有铁氧化还原酶活性，能使Fe2+氧化成Fe3+，又称为亚铁氧化酶(ferroxidase)。CP的酶活性相对而言是非专一性的，其催化的基质包括一些多元醇、多元酚、多元胺等。可以用Fe2+、联苯胺、对-苯二胺、N-N-二甲基苯二胺、邻联大回香胺等作为底物，测定其酶的活性，其最适pH在5.0～6.0之间。也可用免疫化学方法对CP进行定量测定。以邻联大回香胺二盐酸盐作为底物，在CP的催化下生成淡棕黄色的产物，然后加酸终止反应，并生成紫红色的溶液。根据紫红色颜色的深浅来判断CP酶活性。【实验试剂】1.醋酸盐缓冲液(pH5.0)：准确称取醋酸钠(含三分子结晶水)13.608g或无水醋酸钠8.204g溶解于蒸馏水中，倒入1L容量瓶中加蒸馏水至约990ml，再加入冰醋酸2.6ml，混匀后用0.1mol/LNaOH或冰醋酸校正pH至5.0，最后用蒸馏水补充体积至1000ml，于4℃2.9.0mol/L硫酸溶液3.7.88mmol/L邻联大回香胺二盐酸盐溶液:准确称取邻联大回香胺二盐酸盐250mg，加蒸馏水溶解并定容至100ml，贮存于棕色瓶中4℃保存，至少可稳定3个月。【操作步骤】

试剂(ml)1管(5min

管)2

管(15min管)血清0.050.05醋酸盐缓冲液0.750.7530℃邻联大回香胺二盐酸盐溶液(事先30℃0.20.2准确反应5min

后9.0mol/L硫酸溶液2.0(立即混匀，由水浴中取出)－准确反应10min后9.0mol/L硫酸溶液－2.0(立即混匀，由水浴中取出)用1cm光径比色杯在540nm波长下测定吸光度值，蒸馏水调零。【计算】CP国际单位的定义为：在最适pH和底物浓度下，每分钟能催化1umol底物所需的酶量为一个国际单位。＝(A15min-A5min)×6.34×102式中，A15min：15min管的吸光度；A5min

：5min

管的吸光度；9.46：吸光系数；10：孵育时间之差值；0.05：血清用量(ml)；3：反应液总体积(ml)。【参考范围】

62～140IU/L。【作业与思考题】：1.实验报告内容：将测定的结果和计算结果填写至实验报告上，分析结果，得出结论。2.、血清铜蓝蛋白测定的临床意义。

实验三外周血细胞基因组DNA的提取(NaI法)【实验目的】了解提取DNA的原理，掌握人外周血基因组DNA的提取方法。【实验原理】用NaI法提取白细胞中的DNA可用于Southern杂交、PCR等。例如做亲子鉴定可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。从全血制备白细胞DNA，可用双蒸水溶胀红细胞及白细胞膜，释放血红蛋白及细胞核，使核酸处于易提取状态，加NaI破核膜并使DNA从核蛋白中解离，用氯仿/异戊醇抽提使蛋白质沉淀完全，DNA存在于上层水相中，以异丙醇沉淀DNA，离心去异丙醇，并重复操作一次，即可获得白细胞DNA。【实验试剂】1.器具：离心机、振荡器、Eppendorf管，移液器等。2.试剂：抗凝人外周血，双蒸水，6MNaI溶液，氯仿/异戊醇，70％乙醇，TE溶液。【操作步骤】1.取外周抗凝血（全血）200ul于Eppendorf管中，12000rpm离心12min。2.弃上清，加双蒸水200ul溶解，摇匀20s。混匀后加6MNaI溶液200ul，充分摇匀20s。3.加入氯仿/异戊醇（24：1）400ul，边加边摇，摇匀20s，12000rpm离心12min。4.取上层液350ul，加入另一新Eppendorf管中，加210ul异丙醇，重新摇匀20s，室温放置15min，静置后的反应体系15000rpm离心12min，使沉淀紧贴Eppendorf管壁。5.弃异丙醇，加70％乙醇1ml（不振动，可轻轻颠倒混匀），以15000rpm离心12min。6.弃乙醇，敞开Eppendorf管盖，烘干（37℃恒温箱）后，加1xTE溶液30ul，溶解DNA，制成的DNA液-207.用DNA／RNACalculator检测DNA的含量和纯度。【作业与思考】1.实验报告：将人外周血基因组DNA提取的实验步骤写在实验报告上，测定DNA含量，将测定的结果写到实验报告上，分析结果，得出结论。2.查资料写明2个所查到的DNA提取的方法以及基本原理3.写明NaI，氯仿/异戊醇以及异丙醇在这个实验中的作用。实验四碱裂解法提取质粒DNA【实验目的】了解提取质粒DNA的原理，掌握碱裂解法提取质粒DNA的方法。【实验原理】细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。【实验材料】1.材料：含pUC19质粒的大肠杆菌，1.5ml塑料离心管,离心管架，枪头及盒、卫生纸。2.设备：微量移液器(20ul，200ul，1000ul)，台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器(灭菌锅)，涡旋振荡器，恒温水浴锅，双蒸水器，冰箱等。【试剂准备】1.LB液体培养基：称取蛋白胨(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeastextract)5g，NaCl10g，溶于800ml蒸馏水中，用NaOH调pH至7.5，加水至总体积1升，高压下蒸气灭菌15分钟。2.氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)母液：配成100mg/ml水溶液，-20℃3.溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mMTris-HCl(pH8.0)，10mMEDTA(pH8.0）。配制方法：1MTris-HCl(pH8.0）12.5ml，0.5MEDTA（pH8.0）10ml，葡萄糖4.730g加ddH2O至500ml。在121℃高压灭菌15min，贮存于4℃。4.溶液Ⅱ：0.2MNaOH，1%SDS。配制方法：2MNaOH1ml，10%SDS1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置。5.溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH4.8。配制方法：5MKAc300ml，冰醋酸57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃6.苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。7.无水乙醇；8.70%乙醇；9.TE：10mMTris-HCl(pH8.0)，1mMEDTA(pH8.0)。配制方法：1MTris-HCl（pH8.0）1ml，0.5MEDTA（pH8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。121℃高压湿热灭菌20min，4℃保存备用。1MTrisCl（Tris(三羟甲基)氨基甲烷）：800mlH2O中溶解121gTris碱，用浓盐酸调pH值，混匀后加水到1L；0.5MEDTA（乙二胺四乙酸）：700mlH2O中溶解186.1gNa2EDTA.2H2O，用10MNaOH调pH8.0(需约50ml)，补H2O到10.RNA酶A母液：将RNA酶A溶于10mmol/LTris·Cl(pH7.5),15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的溶液，于100℃加热15分钟，使混有的DNA酶失活。冷却后用1.5mleppendorf管分装成小份保存于-20【操作步骤】1.挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于20mlLB（含Amp100ug/ml）液体培养基中，37℃2.取1.5ml培养液倒入1.5mleppendorf管中，12000rmp离心1-2min。弃上清，将离心管倒置于卫生纸上，使液体尽可能流尽。3.菌体沉淀重悬浮于100ul溶液Ⅰ中(需剧烈振荡，使菌体分散混匀)。室温下放置5-10min。4.加入新配制的溶液Ⅱ200ul，盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次，以混匀内容物(千万不要振荡)，冰浴5min，使细胞膜裂解（溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。5.加入150ul预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置5min。12000rmp离心10min。溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。6.上清液移入干净eppendorf管中，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀,12000rmp离心10min（450ul的苯酚/氯仿/异戊醇）。7.小心移出上清于一新微量离心管中，加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置2-5min，离心12000rmp×10min。8.弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入1ml70％乙醇洗沉淀一次，12000rmp离心5min。9.吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，室温干燥。10.将沉淀溶于20ulTE缓冲液(pH8.0，含20ug/mlRnaseA，约4ul)中，37℃水浴30min以降解RNA分子，储于-20℃冰箱中。11.用DNA／RNACalculator检测DNA的含量和纯度。【注意事项】1.提取过程应尽量保持低温。2.沉淀DNA通常使用冰乙醇，在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用异丙醇(一般使用等体积)，且沉淀完全，速度快，但常把盐沉淀下来，所以多数还是用乙醇。【作业与思考】1.实验报告：将碱裂解法提取质粒DNA的实验步骤写在实验报告上，测定DNA含量，将测定的结果写到实验报告上，分析结果，得出结论。2.根据以前学习的生物化学知识，简要分析本实验中用到的各种试剂及其成分的主要作用。实验五聚合酶链式反应（绿色荧光蛋白基因的PCR扩增）【实验目的】掌握PCR扩增的基因原理，以及PCR扩增绿色荧光蛋白基因的方法及操作过程【实验原理】PCR即聚合链式反应，它是近年来发展起来的一种体外扩增特异性DNA扩增技术。PCR技术实际上是在模板DNA、引物和４种脱氧核糖核苷酸(dNTP)存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。反应分3步：①变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA；②退火：当温度突然降低时，由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少。③延伸：在DNA聚合酶和4种dNTP底物及Mg2+存在的条件下，5'→3'的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应，以上3步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，数小时之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达2×106～7拷贝。绿色荧光蛋白来源于海洋生物水母，其基因可在异源组织中表达并产生荧光，GFPcDNA开放阅读框架长度约714bp，编码238个氨基酸残基，其肽链内部第65-67位丝氨酸－脱氢酪氨酸－甘氨酸通过自身环化和氧化形成一个发色基因，在长紫外波长或蓝光照射下发出绿色荧光。绿色荧光蛋白是常用的报考基因之一。转染后的细胞可在荧光显微镜或流式细胞仪(FACS)中直接观察基因的表达。本实验利用含绿色荧光蛋白基因的质粒为扩增模板，加入绿色荧光蛋白基因cDNA的上游和下游引物和4种dNTP底物，在TaqDNA聚合酶进行PCR扩增。理论上扩增的PCR产物大小为720kb。【试剂与器材】1.上游引物:5′-TTGGTACCATGGCTAGCAAAGGAGAAG-3′，其序列含绿色荧光蛋白基因cDNA编码区起始的19个核苷酸，其5'端含KpnI酶切位点。浓度为5pmol/ul即50ul反应液中加25pmol绿色荧光蛋白基因。2.下游引物:5′-TAGGGCCCTTATTTGTAGAGCTCATCC-3′，与绿色荧光蛋白基因cDNA编码区最后21个核苷酸互补，其5'端含ApaI酶切位点。浓度为5pmol/ul即50ul反应液中加25pmol绿色荧光蛋白基因。3.DNA模板：绿色荧光蛋白基因cDNA质粒，浓度为2ng/ul，50ul反应液中加入10ng。4.10×buffer浓度（购买Taq酶有配套的Buffer）:500mmol/LKCl，100mmol/LTris-Cl，pH9.0，1%Triton-X1005.10×MgCl2即25mmol/L。6.dNTP2.5mmol/L分别取等体积的10mol/L的dATP，dGTP，dTTP，dCTP四种混合即成。7.TaqDNA聚合酶（国产或进口）：浓度为5U/ul，50ul反应液中加1U。【操作步骤】1.取0.2mlPCR管，按下表操作，各成分终浓度如下：模板DNA50～100ngTaqDNA聚合酶0.5～1ul上游引物(10uM)1ul下游引物(10uM)1ul10×DNA聚合酶缓冲液2.5ul加双蒸水至25ul(建议先算好体积，最先加)2.标准PCR反应循环参数：95℃5min预变性；94℃30s、50℃30s、3.置至4℃或-20【作业与思考】1.聚合酶链反应技术的基本原理是什么？2.聚合酶链反应技术在基因诊断和医学研究中有何应用？实验六限制性内切酶消化实验【实验目的】1.熟悉限制性内切酶的作用原理，掌握质粒的限制性内切酶酶切的方法及操作步骤。2.了解PCR-RFLP的基本原理【实验原理】载体质粒DNA的多克隆位点上具有EcoRI,HindIII等限制性核酸内切酶的识别序列。通过内切酶的作用，可使质粒DNA由环状变为线状。通过与未酶切的质粒DNA及DNA分子大小标准参照物进行琼脂糖凝胶电泳比较，确定酶切点，获得该质粒的限制性酶切图谱。【试剂与器材】1.材料：经构建的pMD19T或其它外源DNA的重组质粒。2.试剂：限制性核酸内切酶EcoRI和HindIII。【操作步骤】PCR产物的限制性内切酶酶解PCR产物10ul10×酶解缓冲液2ul*EcoRIorHindIII（10u/uL）1-2ul加双蒸水至30ul(建议先算好体积，最先加)置37℃PCR产物酶解片段的电泳分离。【作业与思考】1.如何进行双酶切反应，注意事项。2.什么是PCR-RFLP，怎么利用RFLP进行致病基因连锁分析。实验七琼脂糖凝胶电泳实验【实验目的】1.了解琼脂糖凝胶电泳检测的一般原理。2.掌握琼脂糖凝胶电泳检测技术。【实验原理】DNA分子携带负电荷，在一定电解质缓冲