树突状细胞体外培养及形态学观察

树突状细胞体外培养及形态学观察

1973年，tranman和cohn首次从树突状细胞中分离，这是一个已知的具有强大功能的全职抗生殖器。近年来有关树突状细胞的表型、功能及肿瘤的生物学治疗等方面的研究已成为热点。由于树突状细胞在体内的含量极低,限制了树突状细胞的研究和应用。树突状细胞的来源包括骨髓、外周血和脐血,其中骨髓以其来源广泛、经济和富含树突状细胞的前体细胞等特点倍受关注。本研究从小鼠骨髓中获取树突状细胞的前体细胞,然后在细胞因子的作用下培养出成熟的树突状细胞,并对其进行鉴定和形态观察,为研究树突状细胞提供必要的条件和形态学基础。1材料和方法1.1小鼠骨髓内的自由生长BALB/c小鼠20只,雌雄各半,体重18～22g,周龄6～8w,无菌环境饲养。由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供。取20只BALB/c小鼠,经脱颈椎处死,立即浸入75%酒精中。在超净台内无菌游离股骨,尽量将肌肉和结缔组织去除干净,然后放入无菌PBS中。剪掉股骨两端,用含有RPMI1640培养液(博士德生物工程有限公司)无菌注射器冲洗骨髓,离心后,放入含有10%小牛血清(博士德)的RPMI1640培养液中(含青霉素100U/ml,链霉素100μg/ml),置于37℃、5%CO2培养箱中培养。3h后倾去悬浮的细胞,更换新的培养液,同时加入GM-CSF(终浓度500ng/L)和IL-4(终浓度200ng/L),二者购自美国PEPROTECHECLTD公司。每3d更换1次培养液。1.2小鼠s-100蛋白培养14天的细胞经离心后,进行细胞涂片,丙酮固定,常规免疫组织化学染色,一抗采用兔抗小鼠S-100蛋白。培养14天的细胞经离心后,3%戊二醛固定,常规电镜样品制备。2结果2.1细胞培养后细胞的形态变化由小鼠骨髓直接分离的树突状细胞量很少,经GM-CSF和IL-4诱导分化培养3天后树突状细胞量逐渐增多,两周后经细胞计数可扩增至70%～80%。在相差显微镜下,可见培养1d的细胞贴壁生长,有细胞聚集现象,呈均匀分布的细胞集落。细胞个小,形状不规则,边缘可见细小伪足,无树枝样突起(图1)。培养3d后,细胞成簇生长,大多数细胞仍然贴壁,少数细胞处于半悬浮状态,细胞体积与原先接近,细胞核呈圆形或椭圆形较小,细胞周边可见细胞毛刺状突起,但毛刺较短,分支较少(图2)。培养5d后,较多细胞呈半悬浮生长,可见大部分细胞呈梭型及不规则形状。细胞体积较以前增大,细胞分别聚集生长,胞体增大,周边可见明显的刺状突起,突起较原先长,可见分支(图3)。培养7d后,细胞体积较前增大,周边刺突十分明显,突起较粗大,分支较明显,细胞形态似星形或梭形,细胞核明显,细胞聚集生长(图4)。培养10d后,细胞生长旺盛,细胞体积增大,具有明显树枝状突起,突起粗大且较长,胞体相对饱满,细胞形态呈星形、多边形或梭形(图5)。培养14d后,大多数细胞出现悬浮生长,呈现典型的树突状细胞形态,培养的树突状细胞比淋巴细胞大,直径在10～20μm之间,细胞呈星形或梭形,形似“海星”。细胞核清晰可见,细胞表面突起增多,细长,分支较多,呈蔓状分布于细胞表面,形似树枝状(图6)。2.2蛋白阳性反应物质培养14d的树突状细胞经S-100蛋白免疫组织化学染色,可见细胞大而突起多,细胞内充满弥散或细颗粒状的棕黄色S-100蛋白阳性反应物质。树突状细胞核大而不规则,细胞形态亦不规则,有的呈梭形,有的呈多边形或星形,有的呈椭圆形或类圆形,细胞表面可见长短不一,粗细不等的毛刺状突起,有的突起细长或短粗,分支较少,有的突起细长且分支较多,形似蔓状分布,细胞表面可见明显树枝状突起(图7,8)。2.3细胞生物学特性培养14d的树突状细胞,电镜下具有典型的树突状细胞的形态特征。细胞体积较大,细胞表面有许多突起,呈粗细、大小、长短不一的树枝状,有的突起较直,有的较弯曲,并且缠绕在一起形成结节状突起。细胞表面不光滑,粗造,凸凹不平。细胞核不规则,呈肾形、椭圆形或马蹄形,染色较深,常偏于一侧,偶见核仁,核内异染色质明显边集,核膜清晰可见。细胞胞体较大,胞浆丰富,细胞器较多。胞浆内有线粒体、粗面内质网、小泡及高尔基复合体和溶酶体。个别细胞表面突起粗大,胞浆内核糖体及内质网清晰可见,部分内质网扩张或线粒体膨胀,说明这些细胞活性高,功能旺盛(图9,10)。3讨论3.1树突状细胞的体外培养树突状细胞是目前为止发现的功能最强的专职抗原提呈细胞,它对诱导初次免疫应答具有独特的功能,在对抗原的摄取、加工、处理及提呈过程中,树突状细胞既具有一般抗原提呈细胞的共性,也表现出一些独特的生物学特性。由于它在机体的抗感染免疫及抗肿瘤免疫应答中的作用极其重要而倍受重视,成为近年来免疫学研究的热点。但树突状细胞在体内分布广泛且数量较少,因此如何获得大量的树突状细胞就成为进一步研究树突状细胞特性和功能的前提,近年来,许多学者对树突状细胞的分离和纯化技术不断改进和提高,现已能够从大多数组织中得到高纯度的,各具特性的树突状细胞。树突状细胞的纯化方法包括两大类:(1)物理方法:①根据细胞的粘附性进行分离,有粘附分离法、尼龙毛分离法、羰基碳分离法。②根据细胞的大小比重进行分离,包括聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Paque)密度梯度离心、Percoll非连续性/连续性密度梯度离心、E花环沉淀分离;(2)免疫分选:包括淘洗法、流式细胞术(FCM)、磁性细胞分离术(MACS)。从组织的来源可分为:(1)从外周血直接分离树突状细胞。(2)从树突状细胞前体诱导并扩增树突状细胞:①从CD34+干细胞前体诱导并扩增树突状细胞;②从CD34+前体细胞扩增树突状细胞;③从CD14+前体细胞扩增树突状细胞;④从骨髓干细胞扩增树突状细胞。(3)从淋巴液分离树突状细胞。(4)从其他组织中分离树突状细胞,如肠粘膜下层、集合淋巴小结、肠系膜淋巴结、脾和外周淋巴结等。因为树突状细胞在各种器官组织中的含量都非常稀少,以至很难获得大量树突状细胞,所以研究中大多采用几种方法综合运用。由于树突状细胞在体内含量极低,而且提取物中又含有其他细胞,因此树突状细胞的体外培养关键问题是树突状细胞的分离、提取和必要的刺激诱导分化因子。最近国内外学者从人的外周血、脐血、猪的骨髓、大鼠和小鼠的骨髓等分离培养树突状细胞获得了成功,但这些方法技术要求高、费用昂贵和需要一定的设备而使其实际应用受到限制。本实验采用BALB/c小鼠为研究对象,易获得,便于饲养,而且应用广泛。从小鼠骨髓直接扩增树突状细胞,不用分离只要通过离心即可,简单方便,经济实用。小鼠股骨骨髓细胞含量较少,一次取多只小鼠的股骨骨髓,可以保证获取一定量的骨髓细胞。在培养的过程中,通过细胞的粘附性,即贴壁性尽量除去粒细胞,以提高培养树突状细胞的纯度。同时应尽早地加入诱导刺激因子,以便使骨髓干细胞向树突状细胞转化。在树突状细胞发育过程中,GM-CSF具有关键作用,也是树突状细胞诱导中的最基本细胞因子,但在单独GM-CSF作用下,则以生成单核细胞为主,因此还需要加入其他辅助因子。IL-4能抑制培养体系中的中性粒细胞和巨噬细胞的产生,TNF-α一方面抑制粒细胞产生,另一方面促树突状细胞的成熟。IL-3也有抑制粒细胞成熟的作用,但培养的树突状细胞比较幼稚。有研究者用GM-CSF和IL-3对C57BL/6小鼠的骨髓细胞进行诱导分化,培养出大量的树突状细胞,但培养的树突状细胞比较幼稚。林苹等在GM-CSF和TNF-α协同下诱导胎儿骨髓细胞,获得比较典型且较成熟的树突状细胞,但培养的树突状细胞收获率较低。蔡大川等选用SCF(干细胞因子)+MG-CSF+IL-4+TNF-α细胞因子组合在人脐血中分化诱导树突状细胞,获得较纯的树突状细胞。因此细胞因子的存在对于树突状细胞的诱导乃至细胞的存活具有决定性的意义。由此可见,GM-CSF是树突状细胞培养中必不可少的,而其他辅助因子各有优缺点,最理想的方法是多种细胞因子的组合,但其费用昂贵。本实验联合用重组小鼠GM-CSF和IL-4协同诱导培养小鼠骨髓细胞,使树突状细胞前体细胞分化发育为成熟树突状细胞并得到扩增,同时阻抑了巨噬细胞和粒细胞的生长,经体外培养扩增,可达到70%～80%,基本上满足了后继实验对树突状细胞量的要求。这些细胞表现出树突状细胞的典型特征。这是一种诱导和培养树突状细胞的有效可靠方法。3.2树突状细胞生物学特征因为树突状细胞的复杂性,它的鉴定一般要结合其形态结构、分子表达和功能状态三个方面进行。本实验在树突状细胞体外培养过程中,通过相差显微镜观察,培养的树突状细胞由贴壁生长逐渐到悬浮生长,由不成熟的小类圆形形态成熟为细胞饱满、形态不规则、表面有大量树枝样突起、呈星形的典型树突状细胞形态。数量由少到多,两周后经细胞计数可扩增到70%～80%。几乎所有的细胞经S-100蛋白免疫组织化学染色呈阳性表达。电镜下,具有典型的树突状细胞的形态特征,并可见内质网扩张和线粒体膨胀,提示这些细胞功能活跃。根据以上结果,