folin-ulecileu比色法测定总多酚含量

folin-ulecileu比色法测定总多酚含量

植物多酚是自然界抗氧化物中的一种重要药物。它是水果、蔬菜、饮料、茶、红军和咖啡的主要来源。植物多酚具有很强的抗氧化和清除自由基活性,多应用于预防与治疗癌症、中风、冠心病和神经退行性疾病,同时它也是一类抗营养素物质,会阻碍膳食非血红素铁、钙等微量元素的吸收,可见植物多酚对人体健康的影响主要决定于其来源食材中多酚的含量与食物摄入量。目前,国内关于食材中总多酚含量的报道很少,总多酚定量分析缺乏统一的方法,本研究选用了国内外文献报道中应用较多的Folin-Ciocalteu比色法,然而关于FolinCiocalteu法条件的研究较少,并且文献中采用的比色条件差异较大[11,12,13,14,15,16,17,18],如所用碱液的浓度、用量差异很大,显色时间从30min到150min不等,因此,本研究对样品中总多酚的浸提方法和影响含量测定结果的反应条件逐一进行观察,确定最佳反应体系,并在系统的方法学评价基础上,应用该法对收集于河南省南阳市的26种蔬菜和水果样品进行了总多酚的定量测定。1材料和方法1.1试剂与仪器方法样品:辣椒(青、尖)、黄瓜(夏)、番茄(西红柿)、马铃薯、甘薯(红)、四季豆、豇豆、黄豆芽、芹菜(茎、叶)、韭菜、生菜、蒜苗、西葫芦、包心菜(绿)、大白菜(白口)、茄子(紫皮、圆)、苤蓝(白)、白萝卜(长)、胡萝卜、洋葱(紫皮)、大葱、大蒜(白皮)、苹果1(青香蕉)、梨(鸭梨)、香蕉、香瓜,产地河南省南阳市高庙乡。苹果2(红福士,购自南阳市市场)。试剂:没食子酸标准品(纯度≥98%,购自Sigma-Aldrich公司)、钨酸钠、钼酸钠、浓磷酸、浓盐酸、硫酸锂、溴水、碳酸钠、丙酮均为国产分析纯试剂。Folin-Ciocalteu试剂(下文简称FC试剂):于1000ml磨口回流装置内加入钨酸钠50g,钼酸钠12.5g,蒸馏水350ml,浓磷酸(14mol/L)25ml,浓盐酸(12mol/L)50ml,充分混匀,微沸回流10h,称取一水合硫酸锂(Li2SO4·H2O)87.29g,少量多次加入到圆底烧瓶内,滴加溴水数滴,开口沸腾,使溴水完全挥发为止,冷却,定容至500ml,过滤,置棕色瓶中保存备用,使用时用1倍蒸馏水稀释。仪器:7230G型可见分光光度计(上海菁华科技仪器公司);K-Q-500B型超声波清洗仪(昆山市超声仪器公司);101型电热鼓风干燥箱(北京市永光明医疗仪器厂);FA2104型电子分析天平(上海恒平科学公司)。1.2方法1.2.1总多酚含量的测定在含有酚类物质的待测试样中加入一定量的FC试剂和一定量的10%碳酸钠溶液,定容至25ml,在一定温度下避光反应一定时间,以蒸馏水为空白,测定试样液体的吸光度值(absorbency,A),依据没食子酸标准工作曲线的拟合方程,计算试样中的总多酚含量。1.2.2fc对碳酸钠稳定性的影响精确称取20mg干燥没食子酸标准品2份,分别以蒸馏水和80%丙酮为溶剂,30℃超声至完全溶解后定容至100ml,配制成0.2mg/ml的标准溶液,吸取1ml分别加入FC试剂2ml,10%碳酸钠溶液10ml,定容至25ml,40℃避光反应1.5h,以蒸馏水为空白,分别于730、760、765nm处测定吸光度值。1.2.3fc试剂用量的确定(1)显色温度的确定:以1.2.2试验结果确定的溶剂配制0.2mg/ml的没食子酸标准溶液,取6份,每份1ml,按照1.2.1所述试验方法,固定其他试验条件(FC试剂2ml,10%碳酸钠溶液10ml,避光反应1.5h),分别在20、30、40、50、60、70℃下反应,于1.2.2试验结果确定的波长处测定吸光度值,以比较不同反应温度对吸光度的影响。(2)显色时间的确定:同上取没食子酸标准溶液6份,每份1ml,按照1.2.1所述试验方法,固定其他试验条件(FC试剂2ml,10%碳酸钠溶液10ml,40℃,避光),分别反应0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h,于1.2.2试验结果确定的波长处测定吸光度值,以比较不同显色时间对吸光度的影响。(3)FC试剂用量的确定:同上取没食子酸标准溶液6份,每份1ml,按照1.2.1所述试验方法,固定其他试验条件(10%碳酸钠溶液10ml,于40℃避光反应1.5h),分别加入FC试剂0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml,于1.2.2试验结果确定的波长处测定吸光度值,以比较FC试剂用量对吸光度的影响。(4)10%碳酸钠溶液用量的确定:同上取没食子酸标准溶液6份,每份1ml,按照1.2.1所述试验方法,固定其他试验条件(FC试剂2ml,40℃避光反应1.5h),分别加入10%碳酸钠溶液1、2、4、6、8、10ml,于1.2.2试验结果确定的波长处测定吸光度值以比较10%碳酸钠溶液用量对吸光度的影响。1.2.4标准曲线的绘制精密吸取0.2mg/ml的没食子酸标准溶液0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9ml,按照1.2.3试验结果确定的最佳反应条件加入FC试剂和10%碳酸钠溶液,以蒸馏水定容至25ml,避光反应后,以蒸馏水为空白,于1.2.2试验结果确定的波长处测定吸光度,以吸光度为纵坐标,标准溶液浓度为横坐标,绘制标准曲线。1.2.5超声提取法称取苹果样品可食部100g,加入蒸馏水100ml,制为匀浆。称取该匀浆12份,各10g,其中3份以蒸馏水定容,3份加入不等量的没食子酸标准溶液后以蒸馏水定容,3份以50%丙酮溶液定容,3份加入不等量的没食子酸标准溶液后以50%丙酮溶液定容至100ml,30℃超声提取30min,过滤。分别取滤液1ml,按照1.2.1试验方法和1.2.3试验结果确定的最佳反应条件于1.2.2试验结果确定的波长处测定吸光度值。1.2.6方法的重复性试验(1)重复性试验:从一批苹果样品中随机抽取6个,分别取可食部100g,加入蒸馏水100ml,制为匀浆,取匀浆10ml,按照1.2.5试验结果确定的方法提取苹果总多酚,按照1.2.1试验方法和1.2.3试验结果确定的最佳反应条件进行显色反应,于1.2.2试验结果确定的波长处测定吸光度值,计算相对标准偏差(RSD),以评价该方法的重复性。(2)精密度试验:按上述样品前处理、总多酚制备和测定方法对同一苹果待测样品平行测定6次,计算相对标准偏差,以评价该方法的精密度。(3)稳定性试验:取苹果待测样品1份,按照上述总多酚制备和测定方法,分别在工作液显色完全后的10、20、30、40、50、60min测定吸光度值,计算相对标准偏差,以评价该方法的稳定性。(4)加标回收率试验:向已知总多酚含量的苹果待测样品中分别加入300、500、700µl的没食子酸标准溶液,测定并计算总多酚的回收率及相对标准偏差,以评价该方法的准确性和可靠性。1.2.7单因素法提取样品中总多酚含量的确定取待测蔬菜和水果样品(每种取2份平行)可食部100g,加入蒸馏水100ml,制备匀浆后称取10g,按照1.2.5试验中确定的提取方法制备样品总多酚后吸取滤液1ml,按照1.2.1试验方法和1.2.3试验结果确定的反应条件进行显色反应,于1.2.2试验结果确定的波长处测定吸光度值并计算样品中总酚含量。2结果2.1溶剂的选择表1显示,采用不同溶剂溶解没食子酸标准品对显色的影响差异不大。因此选择蒸馏水为溶剂。两种溶解体系中的标准溶液在文献报道的3种波长下吸光度值略有不同,但对应趋势一致,因此选择显色效果最好的765nm为本试验体系的检测波长。2.2反应条件的确定Folin-Ciocalteu显色体系中采用不同反应条件对终反应液的比色效果会产生影响(表2)。其中显色温度、显色时间和10%碳酸钠溶液用量影响较大。随着设定温度的升高,反应液的颜色逐渐加深,在50℃、60℃条件下吸光度值陡增且趋于稳定;反应液的吸光度值在反应时间为1h时达到峰值,继续增加反应时间颜色逐渐变浅;FC试剂与酚类化合物反应后必须在碱性环境下才能显色,因此碳酸钠溶液的用量影响了反应液的显色效果,考察结果显示,当加入10ml10%碳酸钠溶液时,吸光度值发生了较大变化,可见10%碳酸钠溶液与FC试剂的用量比为5:1是适宜的。综合考量工作液吸光度值的大小、稳定性、操作的简便易行及试验成本确定了本试验体系的反应条件:显色温度:50℃;显色时间:60min;FC显色剂用量:2ml;10%碳酸钠溶液用量:10ml。2.3利用线图1以没食子酸标准溶液质量浓度为横坐标,反应液的吸光度为纵坐标,绘制标准工作曲线,见图1。拟合回归方程y=0.0149+4.1023x,相关系数R2为0.9987,表明没食子酸在质量浓度为0~0.20mg/ml范围内与其吸光度呈良好的线性关系,符合朗伯比尔定律,该方程可用于蔬菜样品总多酚的定量测定。2.4提取溶剂的选择超声波浸提法提取植物多酚常用浸提溶剂有蒸馏水、甲醇、丙酮和乙醇,参考文献,选取了蒸馏水和50%丙酮溶液观察溶剂对浸提效果的影响。由表3结果可以看出,两种溶剂浸提多酚的回收率都比较高,差异不大,说明选择超声波浸提法以及浸提参数的设置是合理的。但表4结果表明采用50%丙酮溶液为浸提溶剂,显色更加灵敏而稳定,提取率显著高于蒸馏水,所以确定50%丙酮溶液为样品中总多酚的浸提溶剂。2.5calteu比色法的稳定性按照本研究确定的最佳提取方法和最适反应条件建立的Folin-Ciocalteu比色法的重复性、精密度、稳定性和加标回收率试验结果见表5,6,数据表明,在本实验室条件下,该比色方法显色灵敏,准确可靠,可重复性较好,稳定性很高,完全适用于对待测蔬菜样品进行总多酚的定量测定。2.6河南当地不同种类蔬菜和水果总多酚含量的比较表7列出了应用Folin-Ciocalteu法在最适反应条件下测定的26种河南当地常见蔬菜和水果样品的总多酚含量结果,可以看出鲜豆类(如豇豆、豆芽)和葱蒜类食材总多酚含量相对较高,茄瓜类和嫩茎、叶类蔬菜多酚含量较低。水果中属苹果和香瓜多酚含量丰富。3最佳反应条件的确定及对数据重复保护的意义对食物中酚类化合物总量进行测定,国内外常用高锰酸钾滴定法和各种光谱学方法,如酒石酸亚铁分光光度法、铁氰化钾分光光度法、香草醛法、原子吸收光谱法、化学发光法等。Folin-Ciocalteu比色法是基于FolinCiocalteu试剂-多酚显色反应的可见光分光光度法,其原理是Folin-Ciocalte试剂中的钨钼酸将多酚化合物定量氧化,自身被还原(W6+变为W5+)生成蓝色的化合物,反应液颜色的深浅跟多酚含量呈正相关。由于国内外研究中所选择的反应条件差异较大[3,14,15,16,17,18],本研究对影响多酚浸提效果和显色效果的因素逐个进行考察和优化,确定出本实验建立的最适测定体系,与其他文献报道的最佳反应条件相比也存在差异,认为这与检测环境、实验仪器、样品采摘时间、成熟度、样品中酚类化合物的种类和结构均有关。受现场工作安排和条件限制,最适反应条件优选未能用正交设计,只进行单因素多水平逐一考察,是本研究的缺陷。系统的方法学评价结果显示,按最适反应条件建立Folin-Ciocalteu比色法测定多酚含量结果准确可靠,可多次重复,平均回收率为102.12%,批内重复测量精密度良好,显色完全后稳定性极好。将本次结果与使用Folin-Ciocalteu比色法测定蔬菜多酚的其他文献报道数据进行对比,本实验数据与国内研究结果偏差小,与国外报道数据吻合度相对差一些。由于