细胞凋亡检测方法的研究进展

细胞凋亡检测方法的研究进展

细胞死亡是由基因控制的、高度有序的细胞活动死亡过程，即过程性细胞死亡（pcd）。细胞在一定的生理或病理状态下,遵循自身的程序,自己结束自己生命的过程,最后细胞脱落离体或裂解为若干凋亡小体,而被其他细胞吞噬,不导致炎症反应。细胞凋亡不受到外损伤因素直接导致的被动改变而属机体自身的生理活动,是一种基因指导的生物过程,是对外部或内部的死亡信号作出的反应,贯穿从受精、发育、成熟、衰老的整个生命过程。近年来一直是生命科学和医学领域各专业的研究热点。随着对凋亡研究的不断深入,各种各样检测凋亡的新技术和新方法相继建立,因此在我们的研究中选择哪种凋亡检测方法非常关键。本文就细胞凋亡的概况及四种细胞凋亡的检测方法做一下比较,以期为将来的研究打下理论基础。1凋亡受体的激活Kerr等(1972年)根据形态学的变化,首先提出和描述了一种不同于细胞坏死的死亡方式即细胞凋亡。细胞凋亡的发生是一个很复杂的过程,基本过程大体可以分为:起始阶段、效应阶段和清除阶段。它的发生是渐进性分阶段的过程,我们可以对其事件的发生大致排一个先后顺序:首先是凋亡受体的激活或凋亡诱导因子的活化,然后通过不同途径进行传导,接下来是线粒体的变化及其caspases的活化,这是凋亡的前期事件;接着随着活化核酸内切酶激活,细胞出现凋亡特有的表现:磷脂酰丝氨酸外翻、细胞皱缩、染色质凝集等,直至形成凋亡小体。细胞凋亡的特征:早期形态学改变是细胞皱缩,细胞体积减小,继而细胞核染色质浓聚、固缩,聚集在核膜周边,呈新月状、块状活破裂状;然后是胞浆浓缩、胞膜起泡,最终细胞核裂解成若干碎片,细胞膜将胞质和染色质断片包裹,胞浆内形成多个膜结构尚完整的“小泡”及“凋亡小体”。这不同于细胞坏死表现为细胞膜通透性增高,致使细胞肿胀,细胞器变形肿大,最后细胞溶解破裂,溶酶体酶泄漏,并常引起炎症反应。细胞凋亡在生化学上表现为DNA琼脂糖凝胶电泳呈梯状条带;细胞凋亡无炎症反应。死亡的细胞碎片很快被巨噬细胞或邻近细胞清除,不留瘢痕,不影响其他细胞的正常功能。2检测细胞死亡的方法2.1电镜观察细胞凋亡电镜形态学检测能够为细胞凋亡提供直观的证明,是观察细胞形态变化的最好方法,可清楚地观察到细胞核及亚结构其变化。通过电镜可以观察到有典型的凋亡细胞出现,其特征是细胞核体积缩小,染色质浓缩致密,并沿核膜分布形成新月体状,细胞膜微绒毛消失,但细胞浆内的各种细胞器基本正常。而普通光学显微镜只可以观察到细胞凋亡的大体形态胞膜起泡现象和凋亡小体,但凋亡细胞的形态学变化大多发生在超微结构,因此用光镜观察难以令人满意。电镜形态学观察是迄今为止判断凋亡最经典、最可靠的方法,被认为是确定细胞凋亡的金标准。操作方法:取2mm×2mm×2mm的肌组织块,固定,脱水,浸透,包埋,固化,切片,染色等步骤,透射电镜下观察。对其过程中的各项条件更加严格、更加精细。电镜检测细胞凋亡的缺点是:(1)只能定性,不能定量;(2)切片标本处理过程复杂,设备相对昂贵,对检查者的技术水平要求较高。此方法是判断细胞有无凋亡发生的一种简便方法,且费用低廉。缺点:(1)特异性较差,特征性的(180~200)bpDNA梯带的出现并非凋亡所独有,另外在某些罕见的情况下细胞发生凋亡可无DNA断裂;(2)不易定量;(3)灵敏性较差,耗时长,且要求大量细胞同时发生凋亡才能使电泳清晰2.3凋亡的分析方法(1)流式细胞仪的工作原理。用流式细胞术分析检测细胞凋亡时,必须用荧光染料对细胞进行染色。常用的染料有碘化丙啶(P1),溴化乙啶(EB),丫啶橙,Hoechst33258等。经荧光染料标记过的细胞样品要求制成单细胞悬液,以一定的流速经过喷嘴,流速的选择与检测的目的有关,当液体刚好经过光源发出的激光形成的聚焦区,此时,标记的荧光染料在激发光的激发下发射出特异颜色的荧光信号和散射光信号,信号的强弱与细胞内待测组分的含量呈正比。荧光信号和散射光信号经过光电倍增管和光电探测器接收后转换成电脉冲,送入计算机处理,应用不同的分析软件可分析样品的各种参数,最后以直方图或三维图的形式显示出来。此外,还可以用不同的标记物进行双参数、三参数、甚至多参数的分析。另外,运用流式细胞仪可根据细胞的形态或标记染料的荧光信号对细胞进行分选,以便下一步进一步研究的需要。目前在基础研究中,凋亡的定量分析主要依靠流式细胞术。流式细胞术是检测细胞凋亡的有力工具,具有分析精确、重复性好、费用低廉、分析速度快等优点,再者具有检测的细胞数量大、可定量分析群体细胞的凋亡以及可同时进行其他相关分析的特点。应用流式细胞术检测凋亡细胞的方法主要包括以下三个方面:形态学的检测、DNA含量分析、DNA降解分析(断裂点标记法)。(2)形态学的检测流式细胞术形态学检测的两个基本参数6:前向散射(PSC)反映细胞大小,侧向散射(SSC)与细胞内粒子性质有关,反映细胞的均质性。凋亡细胞一般都出现细胞膜皱缩,核解聚,凋亡小体形成,胞浆浓缩,体积减小等形态学上的特征,经过流式细胞仪的前向角散射(forwardscatter,FSC)和侧向散角射(sidescatter,SSC)分析后,即可区分出凋亡细胞和正常细胞,凋亡细胞的典型特征是前向角散射下降。由于细胞凋亡或坏死均有细胞内碎片增多,故SSC均高于正常。(3)DNA含量分析1)单参数分析PI一步染色法:收集细胞,PBS洗涤2次,冰冻70%乙醇固定,碘化丙啶(PI)染色,流式细胞仪检测细胞DNA含量。细胞经低渗缓冲液或乙醇、TritionX-100处理后通透性增强,胞膜上会出现小的漏洞,由于细胞凋亡后DNA断裂,在洗涤和染色过程中小片断DNA会从细胞内漏出,使细胞DNA含量低于正常的二倍体含量。用染色后分析,会在二倍体峰前出现一个亚二倍体峰,即AP峰(apoptosispeak),可根据此峰的高低或面积计算凋亡细胞的百分率。2)双参数分析通常用Hoechs-PI双染法:正常细胞对其有拒染性,荧光着色浅,凋亡细胞主要摄取Hoechs-PI染料,呈强蓝色荧光,而坏死细胞主要摄取Pl而呈红色荧光,这样就可以根据荧光强度区分正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞。DNA含量分析法快速、准确,简单易行,所需样本少,可大批量定量检测凋亡标本。另外,还可同时进行细胞表面标志检测以明确发生凋亡的细胞种类。缺点:(1)敏感性不高,首先凋亡早期虽然有DNA裂点出现,但尚未出现DNA片断的大量丢失,因此该法不能检测出早期凋亡;其次,发生于S期或G2M期的凋亡细胞即使有DNA片断的丢失,也不低于二倍体细胞的DNA含量。(2)特异性不强,一部分坏死细胞碎片可呈现低荧光,位于二倍体峰前,可导致误检。(4)DNA降解分析(断裂点标记法)细胞凋亡的最后阶段是形成DNA片段,DNA断裂点法检测的即是DNA的断裂片段,即标记DNA断裂的3’-羟基末端,常采用由DNA聚合酶I催化的原位缺口转移(ISNT)或用TdT介导的dUTP原位缺口末端标记TUNEL技术。标记后再进行上机检测。特异性敏感性均比单独使用某种技术有所提高。2.4流式细胞术检测细胞凋亡TUNEL法是利用末端转移酶TdT将标记的脱氧核苷酸转移到DNA缺口或3’羟基末端上,通常使用的核苷酸为dUTP,标记物为地戈辛生物素、荧光素等,标记后的样品与相应的酶联抗体作用后,可催化底物产生颜色反应在普通显微镜下观察。样品被荧光素标记可直接在荧光显微镜下观察或激光共聚焦显微镜下观察或采用流式细胞仪检测。后续有研究对其加以改进,采用不同的修复方法与修复液,结果经改进后TUNEL法能特异显示凋亡细胞核为棕黄色,阴性对照片无棕色反应,正常细胞或繁殖细胞核为蓝色。操作方法:取材,可以制备成石蜡切片、冰冻切片、细胞悬液等,继而根据所购买的试剂盒按上面的说明操作。TUNEL法检测10、11、12细胞凋亡最为敏感、特异的方法,可量化凋亡细胞,动态观察凋亡细胞超微结构的变化以及与细胞表型同时分析。其局限性为只能标记中期及晚期凋亡细胞,不能检测只发生DNA大片段(300bp以上)断裂的凋亡细胞,也不能检测断裂末断的准确数量,因为每个裂断末端结合的标记分子的数量可因不同反应动力学而不同。3细胞凋亡检测方法的选择通过对上述4种检测细胞凋亡方法的比较研究发现,目前实验室尚无一种完美的检测细胞凋亡的手段。众多的研究方法各具特色,也都有一定的局限性,所以在研究细胞凋亡时,需结合既特异、灵敏,又能定量的多种手段来检测。对于细胞凋亡的研究,采用几种方法的联合检测,可以为检测凋亡提供更加全面、准确、客观的实验依据,将具有重要的意义。更重要的是,充分了解各种方法的原理和特点,才能对检测结果做出合理的判断和分析。2.2dna凝胶电泳在上世纪80年代DNA凝胶电泳一度被认为是判定细胞凋亡的金标准之一。凋亡细胞的生化改变关键是DNA链被依赖的Mg、Ca离子激活内切核酸酶从核小体间切断,形成大约(180~200)bp的DNA片段(寡聚核小体)或它的倍数