第二章 基因工程工具酶2

第一节限制性内切酶和DNA分子切割限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)是一类能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列的DNA水解酶，以内切方式水解DNA产生5’-P和3’-OH末端。无法归入上述R-M系统的酶Eco517:单条多肽链组成，同时具有限制和修饰活性mcr和mrr系统自引导的内切酶4.应用限制酶时的注意事项

(1)注意酶的识别序列和切割位点少数酶可识别两种以上核苷酸序列

AccI识别GTATAC和GTCGAC同裂酶(isoschizomers)：Restrictionenzymeswiththesamesequencespecificityandcutsitebutfromdifferentsource.但有些同裂酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性不同，故可用来区分DNA的甲基化作用。HpaII和MspI共同的靶序列是CCGG。4.应用限制酶时的注意事项

(1)注意酶的识别序列和切割位点新裂酶(neoschizomers):Enzymesthatrecognizethesamesequencebutcleaveatdifferentpoints.同尾酶(isocaudamers，isocaudomer):来源不同，识别的靶序列也不同，但切割产生相同的粘末端。如BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII就是一组同尾酶，切割形成GATC粘末端。由同尾酶产生的DNA片段能够通过互补作用彼此连接形成“杂种位点”，连接后一般不能被原来任一种同尾酶所识别，但可能被识别更短序列的限制酶所切割。4.应用限制酶时的注意事项(2)注意酶反应条件,防止星号活性。相同反应条件的酶可以同时酶解DNA样品，特别是在需要快速知道酶切结果时，就显得更有用。在极端的条件下(如高pH和低离子强度、高甘油分数、缺NaCl、存在Mn2+等)，限制酶可以切割类似但不同于其特定识别序列的序列，这种改变的特异性称为星号活性(staractivity)EcoRI*(EcoRIstaractivity)cleavesthesequenceN/AATTN,whereNisanybase,whereasEcoRIcleavesthesequenceGAATTC.4.应用限制酶时的注意事项(3)注意酶的浓度，酶切时不是酶加的越多越好。一般以在20μL反应体积中，37℃条件下每小时水解1μgDNA的酶量定为一个酶单位。根据DNA的用量选择适当的酶量不但可以避免不必要的浪费，也可以保证酶解的质量。4.应用限制酶时的注意事项(4)注意酶在保温过程中活性的变化，从而确定合适的酶解时间。(5)根据DNA的甲基化程度和限制酶对甲基化的敏感性不同选择合适的酶进行切割。所选用的限制酶对甲基化的敏感性；根据DNA的不同来源选择不同的限制性内切酶。第二节DNA连接酶和DNA分子连接DNA连接酶的种类和催化特性粘末端DNA的连接平末端DNA的连接PCR产物的连接1.DNA连接酶的种类和催化特性(1)DNA连接酶的种类大肠杆菌DNA连接酶噬菌体T4DNA连接酶TscDNA连接酶(TaqDNA连接酶)1.DNA连接酶的种类和催化特性(2)DNA连接酶的催化特性需要在一条DNA链的3’末端具有1个游离的-OH,在另一条DNA链的5’末端具有1个磷酸基团(-P)。由于在羟基和磷酸基团之间形成磷酸二酯键是一种吸能的反应，因此还需要有一种能源分子的存在才能实现这种连接反应。大肠杆菌DNA连接酶和TscDNA连接酶利用NAD+作能源；噬菌体T4DNA连接酶利用ATP作能源。大肠杆菌DNA连接酶和TscDNA连接酶一般只能连接粘末端，而噬菌体T4DNA连接酶既可连接粘末端也可连接平末端。2.1.2连接策略连接反应的最适温度是考虑酶作用速率和末端稳定性的折中，一般在4-15C。在高DNA浓度下进行连接反应有利于提高重组子的数量，稀溶液中线性片段的自身环化占相对优势。对线性化的载体DNA用碱性磷酸酶处理，去除5’端的磷酸基团可阻止质粒自身环化和质粒聚合体的形成，提高重组频率。用碱性磷酸酶处理线性化的载体，避免载体重新环化或聚合Inthiscase,circularizationofthevectorcanoccuronlybyinsertionofnon-phosphatase-treatedforeignDNAwhichprovidesone5′-terminalphosphateateachjoin.Onenickateachjoinremainsunligated,but,aftertransformationofhostbacteria,cellularrepairmechanismsreconstitutetheintactduplex.3.3.2Linker连接策略Linker的5’-末端和待克隆的DNA片段的5’-末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后再通过T4DNA连接酶的作用使两者连接起来。接着用适当的限制酶消化具Linker的DNA分子和克隆载体分子，这样的结果使二者都产生出了彼此互补的粘性末端。按照常规的粘性末端连接法，将待克隆的DNA片段同载体分子连接起来3.3.3利用double-1inkers技术，实现外源DNA片段的定向克隆3.3.4Linker连接的缺点如果待克隆的DNA片段或基因的内部，也含有与所加的linker相同的限制位点，这样在酶切消化linker产生粘性末端的同时，也就会把克隆基因切成不同的片段，从而为后继的亚克隆及其它操作造成麻烦。在遇到这种情况时，可改用其它类型的linker。然而若要克隆的外源基因具有较大的分子量时，则往往难以得到恰当的选择。或者是用甲基化酶对DNA进行修饰，但这个步骤十分难掌握，因为它涉及到数种酶催反应。3.Jointheblunt-endedDNA

molecules3.4Jointheblunt-endedDNAfragmentsvia

adaptormoleculesAdaptor(衔接体，接头，衔接头)：是一类人工合成的一头具某种限制酶粘性末端,另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。为方便重新获得完整的外源DNA，adaptor上通常还设计有其他限制酶位点。当它的平末端与平末端的外源DNA片段连接之后，便会使后者成为具粘性末端的新的DNA分子，而易于连接重组。实际困难：处在同一反应体系中的各个DNA接头分子的粘性末端之间会通过互补碱基间的配对作用，形成如同DNA衔接物一样的二聚体分子。5’–P–GATCCCCGGG–OH3’–HO–GGGCCC–PP-CCCGGG-OH-3’HO-GGGCCCCTAG-P-5’

5’-P-CCCGGGGATCCCCGGG–OH-3’3’-HO-GGGCCCCTAGGGGCCC–P-5’P-CCCGGG-OH-3’HO-GGGCCCCTAG-P-5’BamHIadaptorBamHIGGATCCHapIICCGGSmaICCCGGG解决办法：对Adaptor末端的化学结构进行必要的修饰与改造，使之无法发生彼此间的配对连接。修饰后的Adaptor分子的平末端，仍与天然双链DNA分子一样，具有正常的末端结构，而其粘性末端的5’-P则被修饰移走，为5’-OH所取代。两个Adaptor粘性末端之间无法形成磷酸二酯键，而不会产生出稳定的二聚体分子。粘性末端被修饰的Adaptor分子的平末端照样可以与平末端的外源DNA片段正常连接。在连接之后，需用多核苷酸激酶处理，使异常的5’-OH末端恢复成正常的5’-P末端，让其可以插入到适当的克隆载体分子上。第三节DNA聚合酶DNA聚合酶的种类及其特点大肠杆菌DNA聚合酶I及Klenow片段T4噬菌体DNA聚合酶T7噬菌体DNA聚合酶逆转录酶1.DNA聚合酶的种类及其特点1.2DNA聚合酶共同特点都能把脱氧核糖核苷酸连续加到DNA分子引物链的3’-OH末端，催化核苷酸的聚合作用。1.3不同DNA聚合酶的特性E.coliDNA聚合酶I、Klenow酶和T4DNA聚合酶的聚合能力较低，而T7DNA聚合酶则具很强的聚合能力。2.大肠杆菌DNA聚合酶I及Klenow片段

1957年，美国的生物化学家A．Kornberg首次证实，在大肠杆菌提取物中存在一种DNA聚合酶，即现在所说的DNA聚合酶I。是由大肠杆菌polA基因编码，分子量为109KD。2.1DNA聚合酶I的活性多功能性酶：5’→3’聚合酶活性；5’→3’外切酶活性；3’→5’外切酶活性。当dNTPs过剩时，主要是5’→3’聚合酶活性。3’→5’外切酶活性使得该酶具有校正功能，但5’→3’外切酶活性对于作为工具酶不利。2.2DNA聚合酶I催化合成DNA的互补链的条件（1）全部四种脱氧核苷5’—三磷酸dNTPs(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)和Mg2+。（2）带有3’—OH游离基团的引物链。如此DNA聚合酶I才能将脱氧核苷酸加到这段预先存在的DNA引物链的3’－OH末端。（3）DNA模板，它可以是单链的，也可以是双链的。双链的DNA只有在其糖—磷酸主链上有一至数个断裂的情况下，才能是有效的模板。2.3DNA聚合酶I在基因工程中的用途DNA聚合酶I在分子克隆中的主要用途是，通过DNA缺口转移，制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的DNA探针。nicktranslation在DNA分子的单链缺口上，DNA聚合酶I的5’→3’核酸外切酶活性和聚合作用可以同时发生。当外切酶活性从缺口的5’一侧移去一个5’核苷酸之后，聚合作用就会在缺口的3’一侧补上一个新的核苷酸。但由于DNAPolI不能够在3’－OH和5’－P之间形成磷酸二酯键，因此随着反应的进行，5’一侧的核苷酸不断地被移去，3’一侧的核苷酸又按序地增补，于是缺口便沿着DNA分子按合成的方向移动。这种移动特称为缺口转移(nicktranslation)。2.4大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段

由E.coliDNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理后产生出的大片段分子。具5’→3’聚合酶活性，3’→5’外切酶活性；但失去了5’→3’外切酶活性。在基因工程中的主要用途有：修补经限制酶消化形成的3’-凹末端,用[32P]dNTP补平3’-凹端，对DNA片段进行末端标记；

cDNA克隆中第二链的合成；在体外诱变中用于从单链模板合成双链；应用Sanger末端终止法进行基因组DNA测序。其中，对具有3’-凹末端的DNA片段作放射性标记最有效(用α-32P-dNTP)。2.4大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段Klenow酶标记DNA片段末端的原理3.T4噬菌体DNA聚合酶

分离自T4噬菌体感染的E.coli。具有5’→3’聚合酶活性，3’→5’外切酶活性，其外切酶活性比大肠杆菌DNA聚合酶I的活性高200倍。主要用途：给平末端的DNA片段或具有3’-隐蔽末端的