白血病小鼠模型的建立与应用

白血病小鼠模型的建立与应用

牙龈疾病是一种严重的血液循环疾病，其特点是骨髓和其他血液循环组织中的大量无限细胞增生，并进入周围血液。临床症状表现为骨髓、脾、肝等血液循环器官中的血液肿瘤，以及全身组织中的革兰氏病。伴有不同程度的贫血、出血、感染和骨痛。白血病的发病率和死亡率逐年增加,居35岁以下青少年恶性肿瘤的首位。小鼠(mouse,musculus)属哺乳纲(Mammalia)啮齿目(Rodentia)鼠科(Muridae)动物,在遗传学与造血系统等方面和人类十分相似,因此建立小鼠白血病模型以研究人类白血病的细胞分子生物学特性、生化免疫特征、病理生理改变、发病机制以及药物治疗和预后具有重要意义,本文就白血病小鼠模型的建立与应用现状进行综述。1启动社会化模型的小鼠目前最常用于建立白血病模型的有近交系(inbredstrain)和突变系(mutantstrain)小鼠。1.1封闭式繁殖主要包括:BALB/c小鼠、C57BL小鼠、AKR小鼠、L615小鼠等。1.1.1内皮细胞器官所占比例基因型为Aabbcc,毛白色,其特征是肝、脾等富于网状内皮细胞的器官所占与体重比值较大。BALB/c小鼠的白血病发病率雌性为12%,雄性为10%,对放射线极度敏感,常用于单克隆抗体和免疫学研究,在白血病研究中较常使用。1.1.3抗增输注abf小鼠细胞基因突变其它近交系小鼠还有AKR和C58自发白血病小鼠。AKR小鼠最早由洛克菲勒大学随机交配而得,后获得“淋巴瘤病”原种,继而选择培育成白血病高发品系,基因型为aaBBcc,带Thy-la基因,缺乏补体C5,容易诱发免疫耐受性,对白血病因子敏感。当AKR小鼠发育至6~9月龄时,其淋巴细胞白血病自发率为80%,多为胸腺来源的淋巴细胞白血病;C58小鼠是1921年MacDowell用AbbyLathrop的近交系雌鼠与雄鼠交配而来,基因型为aaBBCC,当其生长至6月龄后白血病的发生率>85%,多为淋巴细胞白血病。1.1.4抗高血压药的制备1961年由中国医学科学院输血和血液研究所将普通小白鼠与C57BL鼠杂交所生的子代经近亲交配20代而成,基因型为aabbCC,广泛用于抗癌药物的筛选以及肿瘤免疫与机理的研究。在这个品系基础上我国又陆续培育出L7212、LS783、RS615、AL771、L6565和津638等品系小鼠,主要用于淋巴细胞白血病方面的研究。1.2突变系大鼠主要包括:nude小鼠、SCID小鼠和NOD/SCID小鼠。1.2.1不同品系小鼠的nk细胞活性即裸小鼠,是1962年英国在非近交系小鼠中发现的无毛小鼠。该小鼠第11对染色体上的第Ⅶ连锁群内裸体位点的等位基因发生纯合突变,导致先天性无胸腺和T淋巴细胞功能缺陷,常用“nu”表示裸基因符号,将“nu”导入其他品系小鼠中可获得不同的突变系,如BALB/c-nu、NC-nu、C3H-nu、Swiss-nu小鼠等。纯合子裸小鼠(nu/nu)无毛,无胸腺。成年裸小鼠较普通小鼠的NK细胞活性较高,但其粒细胞数量和活性均比普通小鼠低。裸小鼠的发现为肿瘤学等的研究提供了难得的模型材料,该小鼠已成白血病研究领域中不可缺少的实验动物之一。1.2.2小鼠染色体畸变试验即重度联合免疫缺陷小鼠。1983年由美国Bomsa在近交系CB-17小鼠中发现,由位于第16对染色体的Scid单个隐性基因突变所致。SCID小鼠被毛白色,体重正常,但胸腺、脾、淋巴结的重量不及正常的30%,体内T和B淋巴细胞联合缺陷,是建立急性淋巴细胞白血病(ALL)的有效模型。1.2.3动物模型的应用即非肥胖糖尿病型重症联合免疫缺陷小鼠,是SCID小鼠与糖尿病小鼠的杂交产物,它不仅有SCID小鼠的V(D)J重排缺陷,还缺乏功能性NK细胞及循环补体,抗原呈递细胞分化及功能不良,并且不发生自身免疫性糖尿病,因而是一种免疫缺陷更严重、更易于异种移植成功并可稳定应用的动物模型。NOD/SCID最易于建立AML模型。近年又有研究者在NOD/SCID小鼠模型的基础上导入IL-2受体γ链缺失突变,建立了NOD/scidIL-2Rgamma(null)小鼠。已有报道NOD/scidIL-2Rgamma(null)鼠在人类淋巴造血系统移植和功能方面的研究与应用明显优于普通的NOD/SCID小鼠。NOD/SCID鼠的人类血液系统肿瘤模型能够研究造血微环境、白血病细胞的分化调控机制和潜在的治疗靶点,并且建立在此平台上的体内药敏实验,在指导临床化疗方案设计已显示突出的疗效,所以NOD/SCID小鼠逐渐成为血液学实验研究的有用工具。NOD/SCID小鼠目前被认为是动物模型中用来研究淋巴造血系统移植的“金标准”。但该小鼠价格比较昂贵,不利于开展大规模的动物实验研究。2建立出血大鼠模型的方法目前建立白血病小鼠模型的方法主要有移植小鼠肿瘤模型、自发和诱发小鼠肿瘤模型和基因修饰小鼠肿瘤模型3种。2.1移植性小鼠病变模型移植性小鼠白血病模型的建立又可分为同种移植和异种移植。2.1.1输注白酒小鼠、输注质骨髓染物指将可移植性肿瘤细胞移植于同系或同种动物中连续传代而成。如小鼠白血病模型L615,先用T638病毒给新生的L615近交系小鼠皮下或腹腔接种,发生白血病后,取白血病小鼠的脾或骨髓制成单细胞悬液给正常成年L615小鼠皮下或腹腔接种,发病后再以同样的方法在L615小鼠中连续传代建模。该种方法的建模周期短,重复性好,移植的肿瘤细胞生物特性较稳定,故成为国内外常用的白血病动物模型复制方法之一。自体式同系动物肿瘤移植不产生排导现象,同种移植时可结合注射肾上腺皮质激素、抗肿瘤药物和适量放射等方法,降低宿主免疫排斥反应,提高建模成功率。2.1.2在组织治疗和治疗小体小型中的应用指将人体或其他种属的动物肿瘤移植到另一种属动物身上使其存活并生长。移植性小鼠白血病模型建立首先对实验鼠进行预处理,方法一般分为两种,放射线照射(γ射线4.5Gy或者137Cs2.0~4.0Gy亚致死剂量全身照射)或者化疗药物腹腔注射,使小鼠的全身免疫功能受到抑制,预处理24小时后经过尾静脉或腹腔注射1×106~2×106个瘤细胞,一般4~6周左右成模。李丽霞等通过对裸鼠腹腔注射环磷酰胺预处理,24小时后注射Nalm-6细胞,成功建立了B-ALL小鼠模型,用于药物体内靶向杀伤的研究。Johannes等用γ射线450cGy预照射C57BL/6鼠,24小时后尾静脉注射携带AML1/ETO融合蛋白的原始粒细胞成功建立了AML小鼠模型,用于研究AML的化疗作用。Bertilaccio等通过皮下或静脉注射CLL细胞系MEC1细胞到NOD/scidIL-2Rgamma鼠,建立了CLL小鼠模型,评估CLL的发生和散播。Ishikawa等用纯化的人干细胞静脉注射到NOD/scidIL-2Rgamma幼鼠尾静脉,建立了人类造血系统恶性肿瘤老鼠模型,研究人的造血功能和免疫能力。周斌等将不同密度的人白血病细胞SHI-1注射至SCID小鼠腹腔,成功建立了M5-AML系SHI-1/SCID小鼠模型。2.2动物的家庭暴力诱发性白血病模型一般是利用致癌物质通过口服、注入、埋藏和涂抹等方式使动物发生肿瘤。主要分为自发性动物模型(spontaneousanimalmodels)和诱发性动物模型(inducedexperimentalanimalmodel)。2.2.1化学或理化方法取自动物自然发生,或由于基因突变的异常表达通过定向培育而保留下来的疾病模型。AKR自发白血病小鼠出生时即带有致癌的RNA病毒,对药物的治疗反应类似儿童ALL。这类小鼠白血病模型的自发性肿瘤通常比用实验方法诱发的肿瘤与人类所患的肿瘤更为相似,有利于将动物实验结果推用到人;且其肿瘤发生的条件比较自然,有可能通过细致观察和统计分析而发现原来没有发现的环境的或其它的致癌因素,可以着重观察遗传因素在肿瘤发生上的作用。但是该类方法也存在肿瘤的发生情况参差不齐,不可能在短时间内获得大量肿瘤学材料,观察时间可能较长,实验耗费较大等缺陷。2.2.2诱发性动物模型:研究者通过使用理化和生物因素作用于动物,造成动物组织、器官或全身一定的损害,出现某些类似人类疾病时的功能与代谢紊乱,化学致癌剂、放射线、致癌病毒可诱发肿瘤。1951年Gross首先用AK近交系小鼠白血病组织的无细胞滤液,注射C3H近交系新生乳鼠,分离到一株可连续传代的小鼠白血病病毒,以后其他学者又相继从移植性肿瘤中分离出多株小鼠白血病病毒(MLV)。另外,多环碳氢化合物如二甲苯并蒽和亚硝基脲类等化学物质可诱发小鼠白血病。放射线照射也是致鼠白血病的重要因素,Hattori等以3.5Gy的γ射线照射Swiss小鼠和C57B/6小鼠,发现46%的Swiss小鼠发生B细胞淋巴瘤,50%的C57B/6鼠发生胸腺肿瘤,由此认为γ射线致癌的动物模型主要表现为白血病和胸腺淋巴瘤。诱发性动物模型制作方法简便,重复性好,在短时间内可诱导出大量疾病模型,并能严格控制各种条件使复制出的疾病模型适合研究目的需要,因而在白血病研究中常用,广泛用于药物筛选、毒理、传染病、肿瘤、病理机制的研究。但该模型是通过人为限定方式而产生的,多数情况下与临床所见自然发生的疾病有一定差异,且许多人类疾病目前还不能用人工诱发的方法复制,因而又有一定的局限性。2.3基因修养大鼠狼模型基因修饰小鼠白血病模型包括转基因小鼠和基因敲除小鼠。2.3.1bcr阳性的cml模型指通过不同方法将外源基因导入小鼠受精卵,然后产生携带外源基因的小鼠品系,并能通过生殖细胞将外源基因传递给后代的小鼠。1976年美国科学家Jaenisch等利用反转录病毒把莫氏白血病病毒基因插入小鼠基因组,建立了世界上第一个白血病转基因小鼠系,随后研究者将vtAT与强力霉素结合抑制四环素操纵子调控基因的时相表达,由此构建Bcr-Abl阳性的CML模型。Ohtaki等用人T细胞白血病病毒-1型(HTLV-1)基因,成功建立了转基因小鼠。2.3.2基因型及mb-pcr检测又称基因打靶小鼠,是指利用外源DNA与受体细胞染色体DNA上的同源序列之间发生重组,使之整合到预定位点上,并替代原有基因,从而改变细胞遗传性的方法。Kawagoe等成功敲除MN1-TEL融合基因,构建成AML小鼠模型,用于研究MN1-TEL对白血病的作用机制。随后Carella等进一步构建CBFβ-SMMHC基因敲除小鼠,研究CBFβ-SMMHC致AML发生的机制。Mercher等用OTT-MAL融合基因敲除小鼠模型,成功研究了RBP-J介导的转录和诱导OTT-MAL融合基因在急性巨核细胞性白血病中的作用。3干预小鼠模型的应用和前景3.1白领细胞系的建立SCID小鼠比体外培养体系为人类白血病细胞的生长提供了更为合适的环境,而作为一种“体内组织培养皿”支持人白血病细胞的繁殖,从而为白血病细胞系的建立提供了新的工具。3.2hl60细胞和内皮细胞血管生成在白血病发病机制中起着重要作用,郭海霞等静脉注射HL60细胞和内皮细胞(EC)在NOD/SCID小鼠,14天时出现全身白血病症状,证明人EC可被HL60趋化至骨髓,参与局部肿瘤血管生成,此模型可用于抗白血病血管生成及实验研究。3.3小细胞残留血小板近年来建立了白血病干细胞的“克隆原”检测和PCR技术检测特异的染色体异常等方法用于微小残留白血病的检测。利用SCID鼠建立的白血病模型也可用于微小残留白血病的诊断,有学者发现接种3×106~10×106个ALL复发患者的白血病前B细胞即可导致SCID鼠发生白血病,从而为诊断微小残留白血病提出了新方法。许小平等采用携带绿荧光蛋白(EGFP)基因标记的小鼠多药耐药白血病细胞系P388/VCR-G和DBA小鼠建立了一个检测多药耐药微小残留白血病的小鼠模型,用以证实该白血病模型小鼠对环磷酰胺(Cy)敏感,有较好的药物剂量-生存时间关系,且接种细胞的对数与Cy剂量间有良好回归相关关系,并监测EGFP+细胞是检测小鼠体内微小残留白血病细胞最敏感的方法。3.4对小鼠输注苯二醇酯活性的影响小鼠白血病模型还可以应用于移植免疫的研究。Shapira等通过建立小鼠白血病模型用以研究霉酚酸酯对淋巴因子激活的杀伤细胞活性和移植物抗白血病作用的影响,从而表明霉酚酸酯在小鼠体内不会损害移植物抗白血病作用或减弱淋巴因子激活杀伤细胞的活性。3.5新型抗癌药物的作用谭业辉等使用L615小鼠和L651K细胞株建立了T淋巴细胞白血病小鼠模型,给予75mGy的低剂量辐射后,发现低剂量辐射具有抗淋巴细胞白血病作用。Borch等利用L1210白血病小鼠模型评估一系列新型磷酯酰胺氮芥杂环类抗癌药体内的生物学作用和毒性作用。Zuber等通过建立AML小鼠模型后进行了化疗药物反应实验,发现AML模型鼠化疗药物的体内反应良好。新型抗瘤药物的体内实验结果常不能获得体外培养系统中的抗癌作用。因此,鼠移植白血病模型的体内药敏实验可对肿瘤的治疗方案进行筛查,评价其体内疗效,用以预测并指导临床治疗方案的选择和设计,体内药敏实验的研究平台也适于放疗、内分泌、免疫、基因治疗及分子靶向治疗等。3.6nod-u-2rgama动力Ishikawa等将纯化的人CD34+或hCD34+hCD38-脐带血通过面静脉移植入NOD-scidIL-2Rgamma(null)鼠,造成70%的造血细胞嵌合现象再生,持续24周,且hCD34+原代实验小鼠骨髓移植入第二代NOD-scidIL-2Rgamma(null)鼠中也能重新形成造血作用,表明NOD-scidIL-2Rgamma(null)新生小鼠可支持人HSC的自我更新。4建人类正常造血模型目前白血病小鼠模型