(完整版)CCK8实验原理与步骤

实验1、在96孔板中配置100μl的细胞悬液。将板在培养箱预培养24小时37℃5%O2。2、向培养板加入10μl不同浓度待测物质。3、将培养板在培养箱孵育一段适当的时间（例如：612、24或48小时。4、向每孔加入10μlCCK8溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数。5、将培养板在培养箱内孵育1-4时。在处的吸光度。7定D入10μl0.M的HCL溶液或者1%w/vSDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。4小时内测定，吸光度不会发生。PS：1%w/vSDS溶液配制方法：组份浓度：10%(W/V)SDS配制量：100ml配制方法：1.称量10g的SDS置于100ml烧杯中，加入约8l去，68℃加入溶解2.滴加浓盐酸调节pH至7.23.将溶液定容至1l。注意如待测物质有氧化性或还原性的话在加CCK8之前更换的培养基，去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，扣除培养基中加入药物空白吸收即可。活力计算：细胞活力（％=[A(加药)空]/[0加药（空白]×100A（加药：具有细、CCK8液和药物溶液的孔的吸光度A空白：具有培养基和CCK8溶液而没有细胞的孔的吸光度A（0加药：具胞、CCK8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度*细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力C-8可以用于细胞增殖毒性分析。其基本原理为:该试剂中含有8，它在电子载体(1-MethoxyPMS)的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒染料生成的物的数量与活细胞的数量成正比,因此可以用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。其使用方法在毒性试验中有所区别:1.接种细胞悬液100微升于96板,预先置于37度,5%C2饱和湿度的培养箱内培养2.在每孔内加入10微升的CCK-8试剂.3.把培养板放培养箱内1-4小时根据细胞间有所不同)4在为或以上波长.毒性分析试验:1.接种100微升细胞悬液(5000个/孔)于96板2.预先放置37度5%CO2饱和湿度培养箱培养24小时3.加入10微升不同度的毒质到孔内培养基4.在培养箱内培养48小时.5.在每孔内加入10微升CCK-8试剂,在培养箱内培养1-4小时;6在为或以上.以上步骤摘自CCK-8的说明书,由于涉及到某些原因,我省去了上面的一些推销用语)(价,125元/1000孔)写在前面：一直都像个新手老道过。所有新手的迷茫与无奈我最能。看到园子里有一些同学在问有关CCK8试验的事情当初我也和他们一样像蜘蛛丝缠住头茫苍蝇头扎进园子里期待能找到些解决谜团的只言片语希望我写的非专业文字帮助那些在实验室里没有前行者指点迷津的当然仁者见仁智者见智我是使。过MTT实验，但其实原理及目的都是一样的（反应机理不一样都说CCK8简单点而且数据更稳定以就用了这个试剂盒。CCK8的说明书大家一定要认真阅读，里面很多细节的问题都有提到。而且说明书里提供的一些关于各种细胞的种板数都很有参考价定以下言论全部以细胞毒性试验为如果你做的是促胞生长的药物的药效实验那就另当别论了。摸条件包括12、后的孵育时间4、CCK8试剂加入量5、CCK8试剂加入后细胞孵育也就是不加药物，只加细胞和CCK8。1、种板数：这个要查文献，看你所用细胞别人有无做过，把范围大种首先你要观察多长时间细胞可贴壁完全一般贴壁生长24小时。然后还有在你的实验时间内不同细胞数下孔内生长情况拟定考察4在4天内细刚好铺满还是生长？因为每块板都会设置对照孔也就是含有细胞的培养基+C8个数值是板上的最大数值，CCK8试验最佳OD值在1.0附近，所以这个最大数值最好能控制在1.0右我的实验经验是不要让细胞长满，一旦长满了很断是否堆积生长了对药物能否顺利进胞有影响此为其一二生长不均匀易导致孔间OD据偏差大且OD也很大。2、贴壁生长的时间我一般就直接让它贴壁长24h了，这个时间细胞已经贴壁完全而且这样设置时间对自己验时间也方便人愿意大半夜爬起来做实验吧。3了324h48h72h然后根据数据的稳定性（RSD、OD值的范围0左右）这些来选择最好的时间太长了就没有必要了细胞呆在孔里几天不换液结果可想而知了。4、CCK8试剂加入量，说明书中明确写出建议加入量为培养基体积的10有个问题假设我要孔内是200微升的体系即细胞悬液+药液+CCK8=200微升呢还是细胞悬液+液=2008不算在体系内呢关于这一点文献报道不一致本人最终采用的是后者。5、cck8试剂加入后孵育时间，随着时间的增加，OD值就会增大。总之原则就是把D在1.0左右。这里我考察了0.5h1.0h、2.0h。再说一下关于种板设置问题所周知周围一圈为边缘都是不用来做实验的一般每组样品我会设置6个复的OD去掉最大值与最小余取平均值。我用的是排枪，会省很多，但是也会增大组内误差。这个只有通过校正移液枪和选用最适枪头了。做这个实验我想大家遇到的最该是数据不稳定组内数据偏差大。讲了很多怎样摸条件，个原则，把OD值控制在1.0还有实验操作一定要仔细小心，尽量平行操作。能力有限表达不清的大家凑合着看看吧有疑问的欢迎大家留言讨论，我们的目标是共同进步，。补充谢谢大家的热烈讨论突然想起用酶标仪检测的时候还有一些细节问题园子里也有前辈提过比如孔里不能有气泡如果有气，然了，盖子一定要记得拿掉啊补充说明这几天有同学提出了一个问题这个问题非常好也非常关键：将OD值控制在1.0这个说法是否有依据？这里我还是想提醒大家一定要试剂盒的说明书试想一个试剂盒的上市并且术手段得到认可需要经过多少试验反复。我购买的是同仁化学研究所的CCK8试剂盒，说明书的P7Q23：OD值在什么范围适？答：一般情况下OD值在0.0都可以，在1.0附近好。再说到自己的实验设计酶标仪的原实和紫外分度计是一样的所以UV上很多减小误的注意事项在酶上同用这就能够理解为什么不能有气泡为什么要擦拭干净样品板了悉UV的