紫外可见光谱分析技术

紫外可见光谱分析技术及其进展和应用医学院 宋宗辉 2016201632紫外-可见吸取光谱法概述分子的紫外-可见吸取光谱法是基于分子内电子跃迁产生的吸取光谱进展分析的一种常用的光谱分析法。分子在紫外-可见区的吸取与其电子构造严密相关。紫外光谱的争论对象大多是具有共轭双键构造的分子。紫外-可见以及近红外光谱区域的具体划分如以下图所示。紫外-可见光区一般用波长〔nm〕200-380nm/或380-780nm95%的定量分析都用紫紫外-可见吸取光谱。紫外可见区域1.1分子构造与吸取光谱电子能级和跃迁从化学键性质考虑，与有机物分子紫外-可见吸取光谱有关的电子是：形成单键的σ电子，形成双键的π电子以及未共享的或称为非键的n电子。有机物分子内各种电子的能级凹凸次序以下图所示，σ*>π*>n>π>σ。标有*者为反键电子。电子能级及电子跃迁示意图可见，σ→σ*跃迁所需能量最大，λmax<170nm，位于远紫外区或真空紫外区。一般紫外-可见分光光度计不能用来争论远紫外吸取光谱。如甲烷，λmax=125nm。饱和有机化合物的电子跃迁在远紫外区。生色团π→π*所需能量较少，并且随双键共轭程度增加，所需能量降低。假设两个以上的双键被单键隔开，则所呈现的吸取是全部双键吸取的叠加；假设双键共轭，则吸取大大增加红移，λmaxεmaxλmax150-200nm，乙烯的λmax=185nm；而共轭双键如丁二烯λmax=217nm，己三烯λmax=258nm。n→π*π→π*带；而n→π*跃迁几率小，是弱吸取带，一般εmax<500。很多化合物既有π电子又有n电子，在外来辐射作用下，既有π→π*又有n→π*跃迁。如-COOR基团，π→π*跃迁λmax=165nm，εmax=4000；而n→π*跃迁λmax=205nm，εmax=50。π→π*和n→π*跃ππC=C,C=O,N=N,N=O等称为生色团chromophor生色团的吸取特性见下表。某些生色团及相应化合物的吸取特性200nm〔转变分子的吸取位置和增加吸取强度(auxochrome为具有孤对电子的基团，如-OH,-NH2,-SH含有生色团或生色团与助色团的分子在紫外光区有吸取并伴随分子本身电子能级的跃物质的紫外-可见吸取光谱。1.2其他生色的物质：某些无机金属离子也会产生紫外-可见吸取。如含d电子的过渡金属离子会产生配位体场吸收带。依据配位场理论，无配位场存在时， ， ， ， ， 能量简并；当过渡金属离子处于配位体形成的负电场中时，5个简并的d轨道会分裂成能量不同的轨道。不同配位体场，如八面体场、四周体场、正方平面配位场等使能级分裂不等。金属离子肯定时,分裂能级差E=10Dq的值依以下挨次增大： ；配位体肯定时，E=10Dq的值的增大挨次为M2+<M3+<M4+，3d<4d<5d。在外来辐射激发下，dmax约0.1-100l/molcm，5f电子跃迁产生的ff轨道为外层轨道所屏蔽，受溶剂性质或配位体的影响很小，故谱带窄。少数无机阴离子，如NO- =313nmCO

=217nmNO

=360、2803 max

3 max

2 maxnmN3

max

=230nmCS3

max

=500nm)等也有紫外-可见吸取。影响紫外-可见吸取光谱的因素各种因素对吸取谱带的影响：表现为谱带位移、谱带强度的变化、谱带精细构造的消灭或消逝等。谱带位移包括蓝移〔或紫移，hypsochromicshiftorblueshift))和红移(bathochromicshiftorredshift)。蓝移〔或紫移〕指吸取峰向短波长移动，红移指吸取峰向长波长移动。吸取峰强度变化包括增色效应 (hyperchromiceffect)和减色效应(hypochromiceffect)。前者指吸取强度增加，后者指吸取强度减小。各种因素对吸取谱带的影响结果如以下图所示。蓝移、红移、增色、减色示意图取代基的影响在光的作用下，有机化合物都有发生极化的趋向，既能转变为激发态。当共轭双键的两端有简洁使电子流淌的基团(给电子基或吸电子基)时，极化现象显著增加。给电子基为带有未共用电子对的原子的基团。如-NH,-OH2动性很大，能够和共轭体系中的电子相互作用引起永久性的电荷转移，形成p-共轭，降低了能量， 红移。吸电子基是指易吸引电子而使电子简洁流淌的基max团。如：等。共轭体系中引入吸电子基团，也产生电子的永久性转移， 红移。电子流淌max性增加，吸取光子的吸取分数增加，吸取强度增加。给电子基与吸电子基同时存在时，产生分子内电荷转移吸取， 红移， 增加。max max给电子基的给电子力量挨次为：-N(CH)>-N(CH)>-NH>-OH>-OCH>-NHCOCH>-OCOCH>-CHCHCOOH>-H252

32

3 3 3 2 2吸电子基的作用强度挨次是：-N+(CH)>-NO>-SOH>-COH>-COO->-COOH>-COOCH>-Cl>-Br>-I33 2 3 3,n*轨道能量降低大于轨道能量降低，因此波长红移。而产生n *跃迁的n电子由于与极性溶剂形成氢键，态n轨道能量降低大n *跃迁能量增大，吸取带蓝移。波长最短，溶液呈黄色。吸取定律摩尔吸取系数表示吸光物质对指定频率光子的吸取本领，因此由可以估量分光光度法所能到达的理论灵敏度。只有当光子在近似分子大小范围内与吸光分子碰撞时，才能产生吸取。分子截面积越大，碰撞的几率越大。光束强度越大，总光子数越多，吸取跃迁几率越大，产生的吸取越大。因此，式中， 为阿伏伽德罗常数；为吸取跃迁几率，假设每次碰撞对光吸取都有效，；是吸光分子的截面积，约为 ；是光束强度；代表分子随机取向的统计因子； 表示吸取层厚度。吸取定律的适用性吸取定律俗称比尔定律，其成立条件是待测物为均一的稀溶液、气体等，无溶质、溶剂及悬浊物引起的散射；入射光为单色平行光。ab解离、缔合、生成络合物或溶剂化等会比照尔定律产生偏离。cde杂散光(非吸取光)也会比照尔定律产生影响。f其他影响因素包括溶剂、光效应等也应考虑。4紫外可见光谱技术的进展紫外吸取检测器的进展紫外吸取检测器又分二维检测器和三维检测器。三维检测器有扫描型和二极管阵列式。紫外-可见光〔UV-VIS〕检测器原理：基于Lambert-Beer外光或可见光具有吸取，且吸取强度与组分浓度成正比。很多有机分子都具紫外或可见光吸取基团，有较强的紫外或可见光吸取力量，因此UV-VIS检测器既有较高的灵敏度，也有很广泛的应用范围。由于UV-VIS对环境温度、流速、流淌相组成等的变化不是很敏感，所以还能用于梯度淋洗。一般的液相色谱仪都配置有UV-VIS检测器。用UV-VIS了得到高的灵敏度，常选择被测物质能产生最大吸取的波长作检测波长，但为了选择性或其它目的也可适当牺牲灵敏度而选择吸取稍弱的波长，另外，应尽可能选择在检测波长下没有背景吸取的流淌相。紫外检测器是二维检测器，选择一个特定的波长检测,一般用于已有文献和样品200-800nm于不知道样品最大吸取波长的状况下,选择一个波进步行定量,也可以通过观看紫外光谱,可以做到肯定程度上的定性。一般用于紫外分光光度计。紫外检测器是在同一时间测量一个波长下的数据，而二极管阵列是在同一时间分别测量N个波长下的数据。由于要同时测量N点数据，所以要用损失精度来换取，也就是说，紫外检测器的检测精度要远高于二极管阵列，但二极管阵列可以在同一时间给出不同波长的谱图，也就是三维谱图。二极管阵列检测器〔diode-arraydetector,DAD〕：以光电二极管阵列〔CCD列，硅靶摄像管等〕作为检测元件的UV-VIS检测器.它可构成多通道并行工作，同时检测由光栅分光，再入射到阵列式承受器上的全部波长的信号，然后，对二极管阵列快速扫描采集数据，得到的是时间、光强度和波长的三维谱图。与一般UV-VIS检测器不同的是，一般UV-VIS检测器是先用单色器分光，只让特定波长的光进入流淌池。而二极管阵列UV-VIS检测器是先让全部波长的光都通过流淌池，然后通过一系列分光技术，使全部波长的光在承受器上被检测。二极管阵列检测器可以获得全波长的样品信息，而且可以依据吸取光谱关心定性。但相对来说，特地的紫外检测器灵敏度能高一些。紫外可见光谱技术的应用定性分析推断异构体：紫外吸取光谱的重要应用在于测定共轭分子。共轭体系越大，吸取强度越大，波长红移。如： 和前者有紫外吸取，后者的 <200nm。同样，CHCOCHCHCOCH的最大吸取波长max 3 2 2 3要短于CHCHCO-COCHCH3 2 2 3光系数要远大于酮式，也是由于烯醇式构造中有双键共轭之故。CHCOCHCOOCH CHC(OH)=CHCOOCH2 2 25 3 25酮式( =275nm,=100) 烯醇式( =245nm,=18,000)max max推断共轭状态：可以推断共轭生色团的全部原子是否共平面等。如二苯乙烯〔ph-CH=CH-ph〕顺式比反式不易共平面，因此反式构造的最大吸取波长及摩尔吸光系数要大于顺式。顺式: =280nm,=13,500;反式: =295nm,=27,000max max化合物的验证：与标准谱图比对，紫外-可见吸取光谱可以作为有机化合物构造测定的一种关心手段。定量分析紫外-可见吸取光谱是进展定量分析最广泛使用的、最有效的手段之一。尤其在医院的常规化验中，95%的定量分析都用此法。其用于定量分析的优点是：ab10-4-10-5mol/l10-6-10-7

mol/lc1-3%，有时可降至百分之零点几。分析条件的选择溶剂的选择所选择的溶剂应易于溶解样品并不与样品作用，且在测定波长区间内吸取小，不易挥发。下表为某些常见溶剂可用于测定的最短波长。常见溶剂可用于测定的最短波长可用于测定的最短波长(nm)200220250270

常见溶剂蒸馏水，乙腈，环己烷甲醇，乙醇，异丙醇，醚二氧六环，氯仿，醋酸N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，乙酸乙酯，四氯化碳(275)290335测定浓度的选择

苯，甲苯，二甲苯丙酮，甲乙酮，吡啶，二硫化碳(380)0.2-0.8范围内误差小(A=0.434时误差最小)，因此可依据样品的摩尔吸光系数确定最正确浓度。测定波长的选择一般选择最大吸取波长以获得高的灵敏度及测定精度。但所选择的测定波长下其他组分不应有吸取，否则需选择其他吸取峰。定量分析方法标准曲线法配制不同浓度的标准溶液，由低浓度至高浓度依次测定其吸取光谱，作肯定波长下浓度与吸光度的关系曲线，在肯定范围内应得到通过原点的直线，即标准曲线。通过标准曲线可求得未知样品的浓度。标准曲线法示意图样品组成比较简单，难于制备组成匹配的标样时用标准参加法。将待测试样分成假设干等0,C,C…,C的待测组安排制溶液。由参加待测试样浓度由低至1 2n高依次测定上述溶液的吸取光谱，作肯定波长下浓度与吸光度的关系曲线，得到一条直线。假设直线通过原点，则样品中不含待测组分；假设不通过原点，将直线在纵轴上的截距延长与横轴相交，交点离开原点的距离为样品中待测组分的浓度。标准参加法示意图5.3常见紫外可见光谱法的仪器紫外分光光度计是利用物质对光的选择吸取现象，进展物质的定性和定量分析的光电式器，也是一种光谱仪器。依据电磁辐射原理，不同的物质具有不同的选择吸收，也即具有不同的吸取光谱。通过对吸取光谱的分析可便利的推断物质的内部构造和化学组成。随着工业生产和科学技术的不断进展，以及人们对物质生疏的不断深化，，迫切要求进展的先进的分析技术和仪器，分光光度计就是在这种历史条件下问世和进展的。分光光度计是分光仪器和光度计的一种组合。按工作光谱原理的不同，分光光度计可分为争论物质分子吸取光谱的分光光度计、争论物质中原子吸取的原子吸取分光光度计、争论物质分子荧光放射的荧光分光光度计和争论物质原子荧光放射的原子荧光分光光度汁、研究分子喇曼散射光谱的喇曼光谱仪等。由于分光光度法具有分析精度高、测量范围广、分析速度快、样品用量少等优点，分光光度计已成为探究自然、改造自然、进展科学技术和生产的强有力的工具，是现代化分析试验室必备的常规仪器之一。分光光度计的根本组成a、光源光源指一种可以放射出供溶液或吸取物质选择性吸取的光计内装有光强度补偿装置，使不同波长下的光强度到达全都医学教育`网搜集整理。350nm～2500nm用范围是360