选修三 专题一1.2基因工程的基本操作程序

真核生物的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点前体信使RNA成熟的信使RNA第二节

基因工程的基本操作程序（一）获得目的基因（二）构建基因表达载体——形成重组DNA分子（三）将目的基因导入受体细胞（四）目的基因的检测与鉴定基因工程的基本操作程序用DNA合成仪人工合成利用PCR技术扩增已知序列：从基因文库获得未知序列：（一）目的基因的获取：目的基因即我们所需要的基因。基因组文库：含某种生物的全部基因部分基因文库：含某种生物的部分基因（如cDNA文库）cDNA文库基因组文库从基因文库中获取目的基因鸟枪法：散弹射击法供体细胞DNA限制酶许多DNA片段载入载体导入受体细菌扩增产生特定性状分离目的基因构建基因组文库并获得目的基因：目的基因的mRNA逆转录单链DNA合成双链DNA（目的基因）逆转录法构建cDNA文库并获得目的基因载入载体导入受体细菌扩增产生特定性状分离目的基因蛋白质氨基酸序列推测mRNA的核苷酸序列推测结构基因的核苷酸序列（单链）根据已知氨基酸序列直接合成DNA化学合成——人工合成核苷酸序列已知，把将要合成的DNA序列输入到DNA合成仪，用化学方法直接人工合成聚合酶链式反应（PCR：PolymeraseChainReaction)

KaryB.MullisPCR是由美国科学家穆利斯提出的一种体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法，此技术获得1993年诺贝尔化学奖。

PCR的反应体系模板：DNA原料：四种脱氧核苷酸；酶：Taq酶（TaqDNA聚合酶）嗜热细菌中分离得到引物：DNA片段Mg2+（维持酶活性所必需）PCR缓冲液：维持PH恒定，保护Taq酶

PCR反应过程可分为三步：变性、退火、延伸1．变性

双链模板DNA解离为单链结构。（90～95℃）DNA 双链DNA 单链变性2．退火

引物与模板互补成双链。（55～60℃）(由于引物浓度高，序列短，所以易与模板结合。)PCR反应过程可分为三步：变性、退火、延伸引物PCR反应过程可分为三步：变性、退火、延伸3．延伸

在Taq酶作用下，合成特异DNA序列。70～75℃延伸变性第二次循环退火第二次循环延伸第二次循环㈡

PCR反应曲线

理论上，PCR反应产物呈指数增长，但这种增长形式在扩增25-30个循环以后便放慢直至停止，达到反应平台。此时扩增产物量不再随循环次数的增加而呈指数增长。PCR仪程序设定PCR的应用PCR具有省时、操作简便、特异性强、灵敏度高、效率高、应用范围广等特点。PCR技术在分子生物学、医学和案件侦破等领域得到广泛应用。实例1：1、下列获取目的基因的方法中需要模板链是（）A.从基因文库中获取目的基因B.利用PCR技术扩增目的基因C.反转录法D.通过DNA合成仪利用化学方法人工合成（二）基因表达载体的构建—形成重组DNA分子切割目的基因和质粒的限制酶是同一种限制酶吗？同一种目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代，使目的基因表达和发挥作用。（三）将重组DNA分子导入受体细胞常用的受体细胞：有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。主要借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。导入方式：（三）将重组DNA分子导入受体细胞导入微生物细胞：受体细胞：大肠杆菌CaCl2细胞壁的通透性增大重组质粒进入受体细胞导入植物细胞：土壤农杆菌转化法基因枪法：

单子叶植物常用的一种基因转化方法，但成本较高。花粉管通道法：

十分简便经济的方法。我国的转基因抗虫棉就是用此方法获得。将目的基因导入动物细胞①方法：显微注射法②程序：重组DNA提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵新性状动物转基因动物1.筛选含有目的基因的受体细胞通过检测标记基因的有无，来判断目的基因是否导入受体细胞。（1）抗药性筛选法：