第13章 基因诊断(lsq)

第六节基因诊断GeneticDiagnosis第十三章

基因诊断基因诊断基因诊断基因变异致病类型内源基因的变异基因结构突变蛋白质质量的异常基因表达异常蛋白质数量的异常外源基因的入侵

病毒感染等(一)诊断水平基因水平(二)诊断材料

DNA和RNA(三)诊断内容1.对于内源性基因来说：基因结构和表达是否异常2.对于外源性基因来说：病毒核酸、细菌质粒、寄生虫DNA

(四)诊断途径1.直接检查基因结构是否存在：DNA点突变、缺失插入、基因重排、染色体畸变、mRNA剪接缺失错位或结构变化等2.检查基因转录产物mRNA：①已经转录还是没有转录？②应该转录还是不应该转录？③

转录正常、过量还是过少？3.检查基因表型：正常还是异常，进行分析研究。(五)诊断目的1.确诊相应疾病或得出相应结论。

2.是防治疾病或基因治疗的根据。基因诊断概念的界定基因诊断概念的界定基因诊断一、基因诊断的概念和特点(一)定义一、基因诊断的概念和特点利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。是以DNA和RNA为诊断材料,利用分子生物学技术,通过检查基因存在、缺陷或表达异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法和过程。基因诊断的原理：DNA诊断----检测相关基因的结构及其表达功能是否正常。RNA诊断----对表达产物mRNA质和量表达的分析。（二）特点（二）特点1．遗传性疾病2．感染性疾病3．肿瘤4．法医学的应用5．组织病理学针对性强特异性强灵敏度高适应性强早期诊断(三)基因诊断方法和传统疾病诊断方法的区别(三)基因诊断方法和传统疾病诊断方法的区别表型诊断(传统方法)基因诊断诊断依据疾病表型变化基因结构异常和表达异常分类临床诊断血清学诊断生化学诊断DNA诊断RNA诊断特异性表型改变在很多情况下是非特异性的，往往难以明确诊断，延误病情以探测基因为目标，只要有特异性探针，利用分子杂交原理即可诊断，具有很高的特异性敏感性探针可用“放标”或“非放诊断灵敏度高，标本只需微量，DNApg水平即可早期诊断因为表型改变往往出现较晚，难以早期诊断在表型改变之前，基因结构或表达已发生改变，故往往可以早期诊断二、基因诊断常用技术和方法*核酸分子杂交技术

Southern印迹杂交

Northern印迹杂交

Western印迹杂交斑点杂交（狭缝杂交）原位杂交*PCR技术*单链构象多态性(SSCP)*限制性片段长度多态性(RFLP)*DNA序列测定*DNA芯片技术

二、基因诊断常用技术和方法杂交信号检测分子杂交样本抽提DNARNAcDNA反转录合成寡核苷酸引物制备和标记探针PCR扩增分子诊断的基本技术流程分子诊断的基本技术流程（一）基因突变的诊断方法1.点突变的诊断:已知点突变：等位基因特异寡核苷酸探针

(PCR/ASO)未知点突变：单链构象多态性分析

(PCR/SSCP)DNA测序(一)基因突变的诊断方法等位基因特异寡核苷酸探针(ASO)杂交法前题：遗传性疾病基因的突变已知(位点和核苷酸序列)设计针对突变和正常的寡核苷酸探针分别进行杂交扩增DNA片段后，在严格条件下进行斑点杂交和洗膜等位基因特异寡核苷酸探针(ASO)杂交法ASO探针法C正常T病人ASO探针GA探针杂交NC膜探针正常人突变纯合子突变杂合子反向杂交(芯片技术)反向杂交(芯片技术)ATCG探针定位正常CT(纯合子)CTCGCA(杂合子)（新突变）（新突变）等位基因特异寡核苷酸分子杂交(ASO)……GTGGGGCAAGGTGAA……

……CACCCCG

T

T

CCACTT…………GTGGGGCTAGGTGAA……

……CACCCCG

ATCCAC

T

T……

基因组DNACCCGTTCCACCCCGATCCAC探针ABC

地中海贫血CD17A→T点突变等位基因特异寡核苷酸分子杂交(ASO)镰刀状红细胞贫血症镰刀状红细胞贫血症

Aprobe

SprobeHomoHeteroNormal-

珠蛋白基因点突变：GAG(Glu)→GUG(Val)

Aprobe：ACTCCTCTCGAGAAGTCTGCC

Sprobe：ACTCCTCACGAGAAGTCTGCCPCR/单链构象多态性分析(SSCP)PCR/单链构象多态性分析(SSCP)前提：突变未知、序列未知步骤：先确定有无突变、再确定突变位置是一种基于单链DNA构象差别来检测点突变的方法，常与PCR联合应用，称为PCR-SSCP技术。SSCP:相同长度的单链DNA，因碱基序列不同，可形成不同的构象，在聚丙烯酰胺凝胶电泳中产生不同的迁移率。这就是SSCP。PCR产物变性后，经单链构象多态性分析，可分析确定突变是否存在，有了再测序。（检测点突变）PCR产物变性后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常基因和变异基因的迁移位置不同，可分析确定致病基因的存在。---------------------------primer---------------------------

↓

32P-dNTP掺入PCR扩增

产物

↓

变性

↓

单链DNA

↓中性聚丙烯酰胺凝胶电泳

↓

自显影

↓

结果分析123451为正常；2、4、5为纯合患者；3为杂合子Leber病患者是遗传性视神经病(线粒体DNA第11778位基因突变)5

3

3

5

G正常人PCR变性杂交电泳LeberPCR/SSCP病患者分析Leber病患者PCR/SSCP分析5

3

3

5

AG→A正常人纯合突变杂合突变+大片段丢失或插入的诊断Southern印迹杂交多重PCR法少数核苷酸丢失或插入的诊断：点突变2.插入和丢失片段的诊断方法2.插入和丢失片段的诊断方法①跨越断点的PCR基本思路：设计合成一对跨越突变断裂点的引物，将待测DNA样本进行PCR扩增，然后电泳，从扩增片段的大小直接判断是否存在缺失突变。抽提基因组DNA(血液或组织)HindⅢ消化,琼脂糖凝胶电泳凝胶放入碱性溶液,使DNA变性杂交洗膜放射自显影和分析结果ABC缺失HindⅢHindⅢ设计探针标记探针ABC大小Southern印迹杂交②多重PCR引物1和2：确定有无缺失及缺失片段的相对大小。引物3和4：确定缺失部位。利用DNA缺失区或片断插入区的5

和3

引物进行PCR，看扩增片段长度和数量的变异用于检测特定基因序列的插入或缺失致病基因引物4引物1

引物2

引物3电泳杜式肌营养不良症杜式肌营养不良症(DMD)属X-连锁遗传病(XR)DMD基因是最大的基因，有79个外显子DMD基因突变主要以缺失为主，可涉及基因的不同部位引物杜式肌营养不良症

多态性：在人群中，个体间基因组和核苷酸序列存在着差异，即DNA多态性。由于基因的突变发生在限制性核酸内切酶识别位点上,导致限制性片段数目和每个片段长度的不同，称为限制性片段长度多态性。3.限制性片段长度多态性分析3.限制性片段长度多态性(RFLP)限制性片段长度多态性分析流程利用限制性内切酶和特异性探针来检测是否存在基因变异。酶切→电泳→杂交→看片段改变（多、少、长或短，确定是否存在致病基因）结构基因突变(点突变、缺失与插入)限制性内切酶识别位点改变(原来位点消失或产生新的位点或识别位点位移)限制性片段长度多态性分析流程RFLP分析法分析法RFLPAAGC

T

TAAGCT

TT

T

CGAAT

TCGAA123切点切点HindⅢ酶切染色体DNA(a)AAGC

T

TAGACT

TT

T

CGAAT

CTGAA12

切点凝胶电泳分析酶切片段(b)长片段DNA短片段DNA12

+132+1.15kb0.20kb×MstⅡ酶切位点(GCTNAGG)5

3

正常基因5

3

突变基因T→A1.35kbOxaN1镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析+0.2kbP1.15kbP1.35kbP正常人突变携带者患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析酶切电泳放射性探针杂交图谱多态性

-地中海贫血HomoHeteroNormal5.2kb4.6kb

-珠蛋白基因3

末端缺失0.6kbβ-地中海贫血5

3

BgIIIBgIII5.2kb5

3

BgIIIBgIII4.6kb（二）基因表达异常的诊断基因表达异常量的异常质的异常量增多、不该表达而表达量减少、该表达不表达1.mRNA相对定量

(1)点杂交(或狭缝杂交)光密度扫描法；

(2)

RT-PCR；2.