第十四节 真菌及其毒素的检验

第十四节真菌及其毒素的检验

一真菌的形态特征真菌细胞单细胞单细胞呈园或椭园形，常见于酵母和类酵母菌，多细胞多细胞呈丝状，交织在一起成菌丝体，常见于霉菌。1.酵母：大多数为单细胞，卵园形，园形，园栓形或柠檬形，大小和形态，随日龄及环境条件而异，即使在纯培养中，各个细胞的形状，大小亦有差别，在酵母菌的生长过程中形成假丝酵母。假丝酵母:由成熟的细胞和未分化完的细胞连在一起，形成假菌丝，此种酵母称假丝酵母。大多数酵母菌在适宜的培养基上，形成菌落与细菌相似，比细菌的菌落大，表面湿润，粘稠易挑起，有些因时间长而表面皱宿，其色多为乳白色，少数呈红色。菌的颜色、光泽、质地、表面及边缘特征均有鉴别意义。液体培养：有的底部产生沉淀，有的均匀生长，有的在表面生长并形成菌膜或菌醭，厚薄也因种而异，有的甚至干而皱缩，菌醭的形成及特征有分类意义。酵母菌的繁殖无性繁殖：芽殖生殖：多边出芽，两端出芽，三边出芽。芽裂：一端出芽。裂殖：横分裂，如细菌。有性繁殖：由两个有性细胞结合，结合在一起后两个细胞间膜破裂，两个单倍体核向一起集中，最后形成一个繁殖的细胞。2.霉菌：霉菌均由分枝或不分枝的菌丝构成，许多菌丝交织在一起形成菌丝体，菌丝在光学显微镜下呈管状，2～10um比一般细菌放线菌细胞大几倍至几十倍，与酵母菌相似，而其菌丝又分为有隔菌丝和无隔菌丝，再就是根据其功能不同又分为营养菌丝，气生菌丝。无隔菌丝：菌丝为长管状，单细胞，细胞质内含多个核，其生长过程只表现为菌丝的延长和细胞核的裂殖增多，以及细胞质的增加，如毛霉，根霉，犁头霉。有隔菌丝：为大多数的。菌丝由横隔膜分隔成成串的多细胞，每个细胞内含有一个或多个细胞核，有些菌丝外观看起来像多细胞，但横隔膜上有小孔，使细胞质或细胞核，可自由流通，每个细胞功能也相同，如青、曲、白地霉。霉菌的菌丝据其功能又可分为：营养菌丝，气生菌丝。营养菌丝（基质菌丝）就是在生长过程中，伸入到培养的基质中，为真菌提供营养的菌丝。气生菌丝图（繁殖菌丝）它主要是伸入到菌周的空气环境中，它主要作用是产生孢子，产生孢子时的气生菌丝称繁殖菌丝。霉菌的繁殖主要是由繁殖器官产生孢子，繁殖器管是由繁殖菌丝产生的可以是单细胞，也可是多细胞，有时产生无性孢子，有时产生有性孢子，如青霉，曲霉，在生长过程中，由于生长条件的改变，有时产生有性孢子，有时产生无性孢子，但主要还是以无性孢子为主。有性孢子：子囊孢子，结合孢子，卵孢子，担孢子。无性孢子：分生孢子，关节孢子，芽生孢子，孢子襄孢子，厚膜孢子。二、粮食中主要产毒霉菌的形态1．曲霉属：营养菌丝是具分隔的分枝菌丝构成，无色或有明亮的颜色，一部分埋伏型，一部分气生型，分生孢子梗（图2）大部分无横隔，光滑、粗糙或有麻点。曲霉的无性繁殖产生分生孢子，首先由基质菌丝分化出足细胞，足细胞形成直立分生孢子襄，向上伸出于基质表面，单生、不分枝、无隔膜，顶端膨大，形成园球形、棍棒形、椭园形顶襄，顶襄周围密生短杆状小梗，小梗为单层或双层，双层时下层为初生小梗，或梗基柱状。上层为次生小梗，瓶状，向外做辐射状排列，小梗端着生成串的球状分生孢子，分生的孢子一般呈黄色，但也有其它颜色。由顶襄，小梗，分生孢子形成头状体结构称为分生孢子头。2青霉属青霉菌的菌丝体无色，淡色或鲜明的颜色，具有分隔、埋伏型或部分理伏型部分气生型，气生菌丝密毛毡状，松絮状或部分集结成菌丝索，埋伏菌丝或气生菌丝产生直立的分生孢子梗（图2），分生孢子梗单独直立或做某种程度的集合乃至密集成为菌丝束，具横隔、光滑或粗糙，上半端产生对称或不对称的扫帚状分枝，在分枝上产生许多分枝的小梗，小梗以断裂的方式形成孢子，在小梗的顶端着生成串的分生孢子，分生孢子为球形、椭圆形、或短柱状，光滑或粗糙，分生孢子为兰绿色、青灰色、灰绿色、黄褐色；菌落为兰绿色，菌周有一圈白色的结构（绒毛状）三真菌的培养真菌的生长对营养的要求不高，一般马龄薯葡萄糖琼脂、沙堡弱、花生c-d，察氏，保存菌种用察氏培养基。霉菌培养温度22～28℃，PH6.5～6.8最适宜，但它可在PH1.7～9.3的环境中生长，一般在温度稍高，湿度较大的环境中生长。真菌的菌落有以下三种类型：1．酵母型菌落：类似于一般菌落，菌落光滑，湿润，柔软致密，显微镜检查可见圆形或椭圆形的生芽细胞，多见于酵母菌、隐球菌。2．丝状菌落：菌落蔬松，呈棉絮状，绒毛状或粉末状，一部分菌丝向上空生长并形成孢子，另一部分菌丝伸入培养基下层，培养基的正面和背面可显示各种不同颜色。。3．酵母样菌落：外观性状同酵母型菌落，但在菌落表面除见生芽细胞外，还有假菌丝伸入培养基中，念珠菌。四产毒霉菌的检验1．样品的采取（1）患病畜禽的病变组织，无菌采取脓汁、肺、肾、肝等，置培养皿中待检：（2）被毛、皮屑、或痂皮，用作皮肤致病性真菌采样时，先在病灶部涂以消毒液，然后用消毒镊子将毛连根拨出，或夹取痂皮、皮屑放入灭菌容器中待检。（3）粮食谷物：根据粮屯、粮垛大小和类型，分层定点（一般分三层，五点）取样，或分层随机采取不同点的检样，充分混匀，取500g左右作检验用。（4）动物饲料：包括干草等一般饲料，发酵饲料，以及发霉的谷物，分层随机取样或采霉变部分，取500g做检验（5）动物性食品：如肉禽、乳及其制品，用灭菌工具采集可疑样品250g左右，装入灭菌容器中。2．样品的处理与分离培养(1)谷物、粮食①内部真菌的分离取样品10～20克，培养前将样品在0.1％升汞中浸泡（玉米、麦粒1～2分钟、米粒0.5分钟），然后用灭菌蒸馏水冲洗3～4遍。或直接用无菌水淘洗，加水应超过样品1～2cm，振荡1分钟倒去水，反复10次。后再用75％酒精浸泡1～2分钟，脱去蜡质膜，再冲洗。用灭菌的小镊子将上述经过处理的检样，胚部向下按等距离排列接种于高渗察氏琼脂培养基平板上，接种时，必须将检样（粮粒）部分地种入培养基中，每个平板接种数量大粒约为5粒，小粒为10粒，每份检样共接种100粒，接种完毕后，置25～28℃培养一周，培养期间应注意观察和记录。②表面真菌的分离：将检样用无菌水洗涤2～3次后，按上法接种，培养和观察即可。（2）动物饲料（干草、发霉谷物等）：将干草剪成1cm左右，放于三角瓶中，然后以无菌操作加入无菌水，使超过干草1～2cm，盖好瓶塞，充分振荡，将水倒静再换水如上法振荡反复5～6次，最后将水弃去，用小镊子等距离接种于高渗察氏琼脂平板上，置25～28℃，培养1周观察并记录之。（3）块状食品：用无菌小刀取食品的各个部位，分别用小镊子将食品碎块接种于高渗察氏琼脂平板上或研磨稀释后接种，置25～28℃培养1周，逐日观察并记录。（4）液状（粉状）食品：以无菌操作称取检样5g（ml），放入装有50ml灭菌蒸馏水的三角瓶中，经充分振荡1～2分钟，10×倍比稀释，根据标本的污染情况，选择2～3个适宜的稀释度，分别吸取1ml，稀释液于无菌平皿中，用高渗察氏琼脂培养基作倾注培养，每个稀释度作二个平皿，然后置于25～28℃培养1周，观察记录生长情况。3．显微镜检查法（1）不染色压片标本检查法①病组织或脓汁：取洁净玻片数片，于每片滴加生理盐水一滴，然后用白金耳蘸取检样，混于生理盐水中，盖上盖玻片即可直接镜检。②被毛、皮屑、角质：将检样置于载玻片上，滴加10％苛性钾液1～2滴，盖上盖玻片，静置5～10分钟，再将此玻片在酒精灯上微微加温，轻压盖玻片将毛屑等物压扁而透明时即可镜检。③块状食品、谷物或草料：于洁净载玻片上预先滴加生理盐水一滴，再用小刀或分离针刮取霉变部一小部分，轻轻混于盐水中，使其扩散，盖上盖玻片，即可镜检。④培养物：用组织分离针取下菌落一小部分移于预先滴加有生理盐水的载玻片上，任其轻轻扩散，盖上盖玻片后即可镜检。（2）染色检查法一乳酸酚棉兰法染色液：石炭酸10g乳酸10g甘油20ml棉兰0.025g蒸馏水10ml。制片方法：用毛细吸管吸取一小滴上述染液于洁净的载玻片上，再用组织分离针从菌落上挑取少量培养物轻轻的放在液滴中，然后慢慢地盖上盖玻片，尽量避免出现气泡，放置10～15分钟后镜检。4．培养检查法：（1）试管培养：将培养材料接种在琼脂斜面上，于25～26℃下培养。（2）培养皿培养：将培养材料接种于琼脂平板上，由于培养面积大，适于观察菌落全貌，但要注意保持培养环境有一定湿度，防止培养基干裂，影响真菌生长。（3）小培养（即玻片培养法）本法适应于观察真菌的生长状况及其形态构造，是用一特制的金属环放在载玻片上，加上盖玻片即成，金属环内经约为15mm，高约为2mm，金属环成U型，接种前，将金属环连同盖玻片，载玻片一起包好，进行干热或高压灭菌备用，小培养法：①取经过灭菌的金属环，浸于已经熔化好的灭菌石蜡中，然后取出放在灭菌的载玻片上，并在环上加上已灭菌的盖玻片。②在酒精灯上微微加温，待凉后，载玻片，金属环和盖玻片即粘合在一起。③将玻片测立，用毛细吸管取熔化了的真菌琼脂培养基，从环的缺口处注入金属环底部，其量以不超过环的下半部为度。④待琼脂凝固后，即可用接种针挑取真菌纯培养物少许，从环的缺口刺入培养基内。⑤放25～28℃逐日观察。5．真菌的鉴定（1）显微镜检：①菌丝：气生、营养菌丝的宽度，横隔有无、色泽，特殊菌丝器官，如假根足细胞、结节、隆起等特征。②成熟的子实器官：孢子襄、子襄果、分生孢子梗、菌丝体、分生孢子盘等的特征，颜色、形状、大小和着生方式。③孢子：无性：孢子襄、分生、芽生、关节、厚膜孢子等。有性：接合孢子、卵、担、子襄孢子等。（2）培养特性的鉴定青、曲、一察氏培养基，镰刀菌、芽枝霉一马铃薯葡萄糖琼脂进行划线或点种于琼脂上，25～28℃，定期观察。①生长速度：培养一定天数（5、10、15天）测大小，描述常以极慢、慢、中等、快、说明。②菌的颜色：包括子实体，气生菌丝、菌核，埋伏菌丝及其颜色。③菌落表面构造：蔬松，紧密、扁平、隆起，凹陷，或皱褶，有无同心环，放射沟，并观察菌全部，中心部，中间部分及边缘部分。④菌落质地：外观似毡状、绒毛状、棉絮状、羊毛状、襄状、粉粒状、明胶状或皮革状。⑤