甲苯胺蓝介导的光动力对大鼠口腔感染伤口的影响

甲苯胺蓝介导的光动力对大鼠口腔感染伤口的影响

光动态治疗是利用特定波长的激光激发光敏剂，并与氧结合产生具有细胞毒性的单态氧和其他活性氧成分。作为一种治疗肿瘤和非肿瘤的方法，获得了临床认可。20世纪初期,人们就知道染料和光的联合应用可以在体外杀死特定的微生物,现已有文献报道:此项技术可有效地杀灭口腔病原微生物和耐药菌株。细菌的耐药性是院内感染的重要因素,因此大量研究致力于发掘抗感染的替代疗法,例如光动力。甲苯胺蓝已被证明是一种能有效对抗许多微生物及其毒性产物的光敏剂,其介导的光动力在治疗局部感染中可能成为抗生素的替代方法。本研究利用甲苯胺蓝介导的光动力对大鼠口腔感染创口进行处理,观察其灭菌效果及对病损的治疗作用,为临床替代抗生素治疗局部感染提供参考。1材料和方法1.1培养基和仪器Wistar大鼠(哈尔滨医科大学附属二院医学实验动物中心提供);甲苯胺蓝(TB,中国上海SinopharmChemicalReagent公司用无菌蒸馏水制成1mg/mL的溶液,0.22μm滤过膜滤菌,避光保存);实验室金黄色葡萄球菌纯菌株,灭菌磷酸盐缓冲液稀释到1010/mL浓度(哈尔滨医科大学微生物实验室提供);甘露醇高盐琼脂培养基(青岛海博生物技术有限公司)。HPD7404光动力治疗仪(美国,波长为635nm的半导体激光,连续输出功率0~520mW,光纤直径0.6mm);MT-600小型振荡器(广州光机电工程研发中心研制,功率<10W,调速范围0~3000r/min)。1.2方法1.2.1进行牙断裂操取体质量(170±10)g雄性wistar大鼠36只,氟乙烷吸入麻醉,去除上颌第一磨牙腭侧牙龈及其下结缔组织,建立2mm×2mm切割创口。止血后,将20μL金黄色葡萄球菌液注入创口并保持5min。普通饲料常规饲养24h后用于实验。1.2.2-半导体激光方法使用温度和时间感染创口模型建立后的36只大鼠随机分为12J组(激光能量12J/cm2)、48J组(激光能量48J/cm2)2个治疗组和1个对照组(无光敏剂和激光照射,局部用生理盐水)。麻醉之后用鼠牵引器牵开口腔。创口用生理盐水冲洗后,每个创面放置3个无菌纸尖并停留10s采集第一次细菌样本,保存于500μL灭菌磷酸盐缓冲液中。在两光动力治疗组的创口缺损处涂10μLTB,并避光保留10min,分别用12J/cm2和48J/cm2半导体激光以0.5cm2光斑面积照射感染创口2min。对照组只单独用10μL生理盐水处理创口缺损处,不用激光照射。随后以上述同样方法第二次采集细菌样本。所有感染创口只治疗1次,随后观察即刻灭菌效果及创口愈合状况。1.2.3菌落测定和转染两次细菌样本用振荡器震荡30s后,灭菌磷酸盐缓冲液系列稀释,取100μL菌液接种于甘露醇高盐琼脂培养基,37℃需氧培养48h,数码照相后,用图像处理软件ImagePro-pus5.0进行处理并计算长出的菌落,记录数据。1.2.4实际创客率检测治疗后大鼠每天称重,同时在创口一侧放置无菌牙周探针作参照,垂直于创面进行照相。用MATLAB7.0.1图像处理软件对照片中的创口面积进行处理。以照片中的牙周探针刻度的1mm长度为基准,截取1mm2面积,作为基准面积,另确定创口边界后截取照片中创口面积,以下列公式计算实际创口面积。实际创口面积=照片中创口面积/基准面积。因为创口边界的确定为手动完成,所以每个创口边界各由3个有经验的操作者确定,共截取3次取平均值。7d后注意观察创口表面是否完全愈合,完全愈合标准为组织颜色正常,质地较韧,探诊无出血。口腔数码微距照相放大后,未见创口。1.3统计分析采用SPSS13.0软件进行重复测量方差分析,两两比较用q检验,检验标准α=0.05。2结果2.1tb治疗前后tb能量与菌落数之间的关系各组初始菌落平均229CFU/mL到240CFU/mL,无显著差异(P>0.05)。光动力治疗后,两治疗组菌落数与治疗前相比均显著减少(P<0.05)。对照组虽较治疗前稍有减少,但无显著差异(P>0.05)。各组治疗后均未达到完全灭菌效果,其中以48J/cm2组最好,3组间有显著性差异(P<0.05)(表1)。光能量与灭菌效果之间的关系见(图1)。在TB浓度1mg/mL,激光能量12J/cm2时,菌落数减少约85%;而激光能量为48J/cm2时,菌落数减少约93%。不同英文字母之间比较有显著性差异(P<0.05)实验组中48J组灭菌率最好,平均92.64%。各组间有明显差异,F=3373.375,P﹤0.001。2.2创伤率和愈合时间模型建立后3组创口面积均逐渐增加,到第2、3天达到高峰,但两光动力治疗组明显低于对照组,其中48J组平均病损面积最小(P<0.05)。此后,到第7天3组创口面积均逐渐变小,其中48J组最小,对照组最大,3组间有显著性差异(P<0.05)(图2)。48J组在第10天有创口开始完全愈合,到13d全部动物创面均完全愈合。12J组在12d出现创口完全愈合,全部愈合时间为15d,对照组到第14天才出现创口完全愈合,全部愈合时间为18d,时间最长(图3)。各组创口完全愈合时间有显著性差异(P<0.05)。0d和1d各组之间无明显差别(F=0.135,P﹥0.05);第2~7天实验组和对照组之间均有差别(P﹤0.01)。3光动力治疗口腔东北部感染的作用甲苯胺蓝是一种有效对抗许多微生物及其毒性产物的光敏剂,由其介导的光动力疗法在杀灭病原微生物方面有很多优势,它能够立刻与微生物结合,几分钟之内就可进行光照灭菌。不但起效快而且不需要在病损部位长时间保持较高的药物浓度。而传统的抗生素疗法通常需要几个小时才能发挥相同的效果。另外光动力还可以防止目标微生物产生耐药性,因为其杀菌的机理和抗生素、消毒药物不同,光动力对微生物杀伤的具体机制被认为是激光激发光敏剂产生的单态氧作用于细胞膜,使胞浆膜蛋白和DNA损伤。作为一种安全的光敏剂,甲苯胺蓝还被用于外科肿瘤界限的确定,而且曾经作为口服药治疗急性苯胺中毒没有发生毒性反应。甲苯胺蓝还具有价格优势,相对于其他临床用光敏剂如光敏素(Photofrin),δ-氨基乙酰丙酸(ALA)和亲脂性二氢卟酚(Ce6),要便宜得多。本研究采用甲苯胺蓝浓度为1mg/mL,因为它可提供最好的杀菌效果。目前有学者开始研究光动力对某些口腔感染的治疗作用,如牙周炎和种植体周围炎等。据报道,大鼠几种感染创口模型已经建立成功而且应用于光动力治疗之中。但是光动力对口腔创口感染的治疗尚未见报道,而口腔的理化环境和身体其他部位有很大区别。本研究首次证实了甲苯胺蓝介导的光动力对于建立在大鼠口腔金黄色葡萄球菌感染创口的治疗作用。实验中,照射时间设定为2min(临床上过长时间不实用),最高光能量为48J/cm2,远低于安全剂量。在48J/cm2和TB1mg/mL组合下约93%的细菌被杀灭,取得了理想的杀菌效果。表明在较低的甲苯胺蓝浓度下12J/cm2、48J/cm2光能量对口腔创口感染可提供有效的光动力杀菌效果。尽管光动力治疗后,有的病损没有停止发展,但在病变高峰时,光动力治疗组病损的面积显著小于对照组(48J组和对照组平均相差5.2mm2),在以后的时间段内,光动力治疗组仍表现为更小的病损面积,而且全部愈合时间也比对照组提前(48J组提前5d)。提示:光动力治疗具有促进大鼠感染创口愈合的作用。其机理可能是由于光动力介导炎症反应或是光动力对细菌毒素的破坏作用,因为虽然许多因素均能影响感染创口的愈合,但是细菌的感染依然起着重要因素。例如Hamblin等经过光动力对小鼠感染绿脓杆菌开放创口进行治疗,其中90%治疗鼠存活下来。FatenGad等报道:使用聚左旋赖氨酸亲脂性二氢卟酚(poly-L-lysine-Ce6)介导的光动力治疗大鼠腿软组织感染模型,治疗侧的愈合明显好于非治疗侧。Tak-WahWong等用100μgofTB和广谱红光治疗致命性V.vulnificus感染的创口,结果发现:即使是在感