3个牙家系的雌核发育系的构建及倍性分析

3个牙家系的雌核发育系的构建及倍性分析

1利用近交方法诱导的牙种质的选育和纯化雅拉奇奥尔加斯是寒冷的下层海水鱼类。它生长迅速，体积大，肉细腻，口感好，营养价值高，深受消费者喜爱。这是中国重要的海生鱼育种品种。山东省沿海地区的年产量为1万吨，产值为1亿元。国内国际市场需求逐年增长。但是,目前牙鲆苗种繁殖亲本或是直接捕获的野生鱼,或是从养殖的成鱼中筛选而出,没有经过系统的选育。为了提高养殖产量、培育高质量的苗种,迫切需要进行牙鲆种质的筛选和纯系的培育。传统育种中常利用近交方法来获得纯合度较高的子代,而人工诱导雌核发育技术也能加快育种目标性状的纯合速度,有利于纯系的建立。在牙鲆、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)、漠斑牙鲆(Paralichthyslethostigma)、真鲷(Pagrosomusmajor)、欧鲈(Dicentrarchuslabrax)等鱼类上利用雌核发育技术诱导产生了雌核发育后代,并对大菱鲆、泥鳅(Misgurnusanguillicaudatus)、大黄鱼(Larimichthyscrocea)等雌核发育后代的遗传特征进行了微卫星分析。吴清江等利用人工雌核发育与性别控制相结合建立了红鲤(Cyprinuscarpio)纯系;张建森等采用家系选育、多系杂交和雌核发育技术相结合的育种方法人工育成了鱼类新品种-建鲤(Cyprinuscarpiovar.Jian)。在牙鲆育种方面,近年来以不同地理种群和构建的抗鳗弧菌牙鲆群体为基础,建立了大量牙鲆家系,并从中筛选出生长快成活率高的牙鲆家系和亲本。本文利用筛选获得的优良牙鲆家系,培育成熟后,通过家系内近交和雌核发育方式,构建了近交系和雌核发育系,对其生长性状进行测定,并利用倍性检测、微卫星标记等生物技术手段对其遗传特性进行了比较分析,以期为进一步开展牙鲆新品种的培育提供科学依据。2材料和方法2.1tfd各体的生长情况2007年利用牙鲆抗鳗弧菌群体、日本群体、黄海群体为基础繁殖群体,建立了牙鲆全同胞和半同胞家系63个,培育并筛选获得了F1代生长快、成活率高牙鲆家系3个,分别为0719,0750和0751。2.2利用组配系统以上牙鲆F1代家系经过人工培育、生殖调控,于2009年春达到性成熟;在繁殖季节利用人工挤压鱼体腹部法分别采集未受精卵和精液。利用采集到的以上牙鲆家系成熟个体未受精卵100mL及对应的同一家系雄鱼精液1mL,采用兄妹近交方式干法受精,受精卵放入事先准备好的3m3水缸中进行孵化和鱼苗培育,从而建立了0750近交系2个,0751近交系1个。在采集精卵的同时剪取亲本鳍条1cm2左右,分别保存在加入酒精的EP管中,用于微卫星标记检测。2.3利用牙成虫培养考察实验用精子取自黄海水产研究所鱼类精子和胚胎冷冻实验室精子库,挑选解冻后活力达到70%以上的鲈鱼精子。该鲈鱼精液是2007年11月于海阳黄海水产公司采集的,并利用MPRS+20%DMSO冷冻保存在-196℃液氮中。用MPRS稀释液将解冻后精子稀释10倍,均匀地平铺于培养皿中,利用4×104μJ/cm2强度紫外线照射处理使其遗传物质失活,与以上牙鲆家系中成熟个体的卵子授精,取出一小部分受精卵放入15～17℃正常海水中培育,做为单倍体对照;其他经遗传物质失活鲈鱼精子剌激过的卵子,授精3min后放入2～4℃海水中冷休克处理45min,然后放入15～17℃海水中孵化和鱼苗饲养,即建立了牙鲆雌核发育家系。共建立0719雌核发育系2个、0750雌核发育系2个、0751雌核发育3个。在采集未受精卵的同时剪取母本鳍条保存在EP管中,并加入酒精保存。牙鲆雌核发育家系及自交家系的建立实验于2009年4月在山东省海阳市黄海水产有限公司进行,家系鱼苗统一在3m3水缸中培育,水流量0.5m3/h,培育水温20～24℃,各水缸水流和水温一致,定时定量的投喂饲料,由专业人员进行牙鲆鱼苗培育的日常管理工作,尽量保持培育环境一致。2.4多重比较试验近交系和雌核发育系鱼苗生长到127d和190d时,分别取40～70尾样本测量其全体长和体重,利用SPSS软件进行方差分析,用Student-Newman-Keuls(SNK)法进行多重比较,P值达到0.05水平为差异显著(P<0.05),达到0.01水平为差异极显著(P<0.01)。利用AGRW=(W2-W1)/(t2-t1)(g/d)(W2指末重,W1指始重,t2-t1指试验日数),计算每个家系生长期内绝对增重率;利用AGRL=(L2-L1)/(t2-t1)(cm/d)计算体长绝对增长率(L2指末长,L1指始长,t2-t1指试验日数)。2.5检测细胞dna含量取0751雌核发育或近交家系单个鱼苗,剪取其肌肉或尾鳍,置于离心管中,将海水吸去,用蒸馏水清洗一遍,加入适量的DAPI特异荧光染液,研磨使细胞分散,加入适量鞘液,用小筛网过滤混悬浮液于样品管中,制得细胞悬液。使用PartecPA-Ⅰ倍性检测仪进行样品分析,测试时各项指标分别为Gain=448.0,速度为2.0μL/s,对照组(二倍体)正常鱼苗处理样品先经过倍性检测仪测定,其峰值和DNA含量作参照标准。样品的鉴定结果经过倍性分析仪内部软件分析处理,转化为DNA相对含量直方图,对直方图上数据进行相应处理,个体倍性按如下公式判断:细胞DNA含量以DNA指数(DNAindex,DI)即峰指数表示,以DI=1.0±0.1为二倍体的判断标准。DI=处理组细胞G0/1峰值道数/对照组细胞G0/1峰值道数均值。2.6pcr扩增及聚合酶系统成分DNA提取参照刘云国等的方法进行。本研究利用的14个微卫星DNA分子标记,来源于Kim等、Ji等开发的微卫星DNA标记,以及Kang等构建的牙鲆图谱,经本实验进一步筛选,对牙鲆特异性高,引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成(表1)。PCR反应体系为15μL,包括10×buffer,0.2mmol/dm3dNTPs,0.2μmol/dm3引物,1U的TaqDNA聚合酶(Tiangen)。反应程序为94℃预变性4min,94℃30s,退火45s,72℃延伸30s,35个循环,最后72℃延伸7min。反应在PTC-200上进行。PCR反应结束后,加入体积的甲酰胺变性剂,95℃变性5min,迅速冰浴冷却。变性产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后,银染显色。2.7位点多态性分析对照PBR322分子量标准确定每个个体的基因型,利用POPGENE软件计算2个家系的等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)和期望杂合度(He)。同时计算了各家系的近交系数(Fis)、平均遗传杂合度(Ave_Het)、并根据Botstein等的分类方法计算位点多态信息含量(PIC)。用GenePop(Version3.4)软件进行各基因座间连锁不平衡分析,χ2检验估计Hardy-Weinberg平衡偏离,χ2检验的概率P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著。偏离指数d值则反映了Ho和He的平衡关系,能够直观的表明家系内杂合子的缺失或过剩,由下列公式计算:d=(Ho-He)/He。3结果3.1家系间的生长情况利用鲈鱼冷冻精子,经过遗传物质灭活后诱导0719,0750和0751家系成熟个体的未受精卵,再利用冷休克法抑制第二极体排出,得到减数分裂雌核发育二倍体,从而建立了以上3个家系的雌核发育系。0719的雌核发育系为46,47号,0750的雌核发育系为21,27号,0751的雌核发育系为20,38,39号;0750的近交系为5,90号,0751的近交系92号。平均生长至127d时,从体长和体重对比结果看,5号家系(0750近交)生长最快(P<0.05),20号家系(0751雌核发育)生长次之,家系47(0719雌核发育)生长最慢(P<0.05)。平均生长至190d时,20号和38号家系(0751雌核发育系)生长最快(P<0.05),46号和47号(0719雌核发育系)生长最慢(P<0.05),20号家系的绝对增重率也最大为1.919,20,38和39号(0751雌核发育系)的平均绝对增重为1.628;46和47号(0719雌核发育系)的平均增重率为1.324,21和27号(0750雌核发育系)的平均增重率为1.179,5和9号(0750近交系)的平均增重率为1.344,92号(0751近交系)增重率为1.176。从所有家系的绝对体长增长率和增重率看,0751雌核发育系的体长增长率和增重率较大。但是同一家系的雌核发育系和近交系相比,0750近交系的体长增长率和增重率大于其雌核发育系(表2,3)。3.2dna相对含量如图1所示,X轴为荧光强度,即DNA的相对含量值,Y轴为细胞相对数量(细胞频率)。核DNA含量测定的结果以直方图的形式表示,直方图中有两个峰(Peak),峰1为DNA相对含量较低、细胞频率高,是有丝分裂中G0-G1期的细胞峰值;峰2为DNA相对含量高、细胞频率较低,是G2-M期的细胞峰值。近交系和雌核发育系峰1的峰指数(index)都为1,近交系峰2指数为1.864,雌核发育系峰2的指数为1.934,峰2的指数都是峰1的近2倍。两家系DNA相对含量平均值(Mean)峰2近似于峰1的2倍,自交系峰2的DNA相对含量58.77,雌核发育系峰2的DNA相对含量61.95,表明两家系的DNA含量相近。雌核发育家系和自交家系的DNA指数均为1.000,说明二者染色体倍性相同,均为二倍体。3.3ekop17-li位点的图谱分析本研究采用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR产物。所采用的14对微卫星引物均能稳定重复地扩增出相应的同源序列。一般而言,1个微卫星座位的特异引物在纯合的材料中只能扩增出1条DNA带。在每个个体中仅出现一条带为纯合子,出现两条带为杂合子。在EKOP17-Li位点的图谱上,兄妹近交系的纯合子达到16.67%,雌核发育系的纯合子达82.35%(见图2),说明减数雌核发育较兄妹近交能使部分基因尽快的达到纯合。说明减数雌核发育较兄妹近交能使部分基因尽快的达到纯合。雌核发育家系的有效等位基因数(1.9369)略低于近交家系(2.0829),也表明雌核发育家系的纯合度高于近交家系。3.4遗传杂合度和基因型在近交家系中,除EKOP-E1-In,EKOP17-Li,EKOP-E1-Ey是高度多态位点以外,其余均为中度多态位点;而在雌核发育家系中,14个微卫星位点均为中度多态位点。近交系14个位点的平均PIC为0.403,雌核发育系为0.366,表明近交家系及雌核发育家系遗传多态性都较低,但雌核发育系低于近交系。近交系和雌核发育系相比较,等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)和期望杂合度(He)、平均遗传杂合度(Ave_Het)、多态信息含量(PIC)几个遗传指数都高于雌核发育系,其中观测杂合度的差异达到了显著性差异水平(P<0.05)。遗传杂合度显示雌核发育群体的遗传一致性较高,该群体的遗传变异较少,遗传多样性较低。近交家系的遗传偏离指数d为0.0915,说明该家系杂合子过剩,而雌核发育家系的遗传偏离指数d为-0.1573,处于杂合子缺失状态,实际纯合子过量,反映了雌核发育更利于基因的纯合。但两家系相比较,近交家系d值更接近0,其基因型分布比较接近于平衡状态。用基于马可夫链模型(Markovchainmethod)的Hardy-Weinberg精确P值无偏估计,对单群体单基因座检测(HWtestforeachlocusineachpopulation)发现,近交系中EKOP-E1-In、Pod2两个基因座分别表现为显著的遗传不平衡(P<0.05)和极显著遗传不平衡(P<0.01)。在雌核发育系中KOP63,Pod2表现为显著遗传不平衡(P<0.05),EKOP17-Li和Poli113TUF两个基因座表现为极显著的遗传不平衡(P<0.01),其余的基因座处于遗传平衡状态(P>0.05)(表4,5)。4繁殖生物学及筛选张建森等利用家系选育、系间杂交和雌核发育技术相结合,成功培育出了淡水养殖新品种建鲤(Cyprinuscarpiovar.Jian),但在海水鱼类养殖方面,除近年来从国外引进大菱鲆等优良养殖品种外,国内在鲆鲽鱼类养殖新品种的培育方面还需做大量的工作。利用人工诱导雌核发育和兄妹近交的方式可以逐步建立鱼类纯系,通过不同纯系之间的杂交可以获得性状优良的品种,为鱼类的品种改良提供重要手段。最早建立纯系一般采用连续近亲交配的方法,但是利用此法至少要经过连续8～10代同胞兄妹交配才能达到目的。人工诱导雌核发育因为父本染色体没有参与合子核的形成而大大地缩短了子代纯合的过程,一般第一代雌核发育后代纯合的比例为0.6,高于兄妹交配(0.25)和自体受精(0.5),第二代雌核发育后代的纯合率可达0.9。抑制第一次卵裂雌核发育的纯合度相当于连续四代的兄妹近交,雌核发育子二代相当于连续八代的近交,这样经过1～2次雌核发育,就可以达到建立纯系的目的。我们对3个近交系和7个雌核发育系的生长性状进行比较,发现在家系生长至190d左右时,0751雌核发育系生长较其他几个近交系和雌核发育系生长快,但是0750的近交系生长快于雌核发育系,理论上遗传的纯合性会对后代的生长会产生影响,特别是利用连续近交的方法建立纯系,可能会出现后代适应力减弱等现象,即“近交衰退”,但在目前近交系中还没有发现明显的近交衰退现象。雌核发育系的生长与母本性状有直接的关系,鱼苗在1龄之前的生长受母体效应的影响也较大,从目前各自交系和雌核发育系生长看,还不能确定是自交系生长快还是雌核发育系生长快。雌核发育系和近交系以后的生长性状及适应能力如何将做进一步研究。对于某一物种,其细胞核中DNA含量是一定的,利用流式细胞仪检测鱼类个体的DNA含量,可以快速直观的检测其倍性。这一技术应用于大黄鱼三倍体、鲫、雌核发育草鱼、半滑舌鳎雌核发育后代等鱼类的倍性分析。本文利用遗传物质灭活的冷冻保存鲈鱼精子诱导并经冷休克的方法建立了雌核发育系。虽然鲈鱼和牙鲆的染色体数目都为2n=48,端着丝点染色体,但二者发育对外界环境要求不同,且胚后发育速度也不一致,因此尽管鲈鱼精子具有和牙鲆杂交的能力,但是杂交的胚胎发育到眼囊期就开始死亡,不能形成尾部,所以利用灭活的鲈鱼精子诱导牙鲆雌核发育可保证正常发育后代的遗传物质中不会有父本基因。倍性分析结果显示,雌核发育系与近交系具有相同的倍性,而且DNA含量相近,保证了雌核发育纯系建立的可靠性。多态信息含量PIC是指后代所获得的分子标记来源于其亲本同一个分子标记的概率。PIC>0.5时,为高度多态位点;0.25<PIC<0.5时,为中度多态位点;PIC<0.25时为低度多态位点。本实验近交家系平均PIC=0.403,处于中度偏高多态基因座水平,雌核发育家系平均PIC=0.366,处于中度多态基因座水平。杂合度能较好地反映群体中等位基因的丰富程度和均匀程度,普遍认为其为度量群体遗传变异的一个最适参数,其大小可以反映群体遗传变异的高低。朱晓琛等用8个微卫星位点对牙鲆雌核发育二倍体家系纯合性进行检验发现,减数分裂雌核发育二倍体平均杂合子比例为0.8224,而本实验近交系和雌核发育系的平均杂合度分别为0.5066和0.4828,雌核发育系相对较低,多样性水平偏低,说明利用本文方法建立的雌核发育系具有较高的纯合度。d值越接近0,基因型分布越接近平衡状态,但是在本文实验结果中近交系出现了2个不平衡位点,雌核发育系出现了4个不平衡位点,这与牙鲆家系的建立和筛选中有意的筛选个别突出性状相符,以上家系是从大量家系中筛选出的长得快、成活率高的牙鲆家系,因此不平衡的位点很可能与以上性状相关,但这一点有待于进一步验证。在野生群体中有效等位基因数目的减少可能是由于捕捞量的加大、生存环境日益恶化等所导致的有效种群缩小,进而使得有效等位基因更容易丢失。养殖环境下由于近亲繁殖和长期的人工筛选,也会导致等位基因的丢失。本研究中近交系和雌核发育系的有效等位基因数偏小(仅2～3),主要是由于近亲交配和母系遗传使其基因位点发生了大量的纯合,导致有效等位基因数偏小。微卫星标记多态程度高,符合孟德尔遗传规律,呈共显性遗传,检测容易、重复性好,在群体遗传研究方面具有重要的作用。牙鲆微卫星DNA同样遵循孟德尔遗传定律,即亲本基因型决定子代基因型,排除基因突变及基因错配情况下,子代单座位的等位基因必定一个来自母本,一个来自父本。雌核发育家系中,理论上子代不存在父本等位基因,子代等位基因应全部来自母本。本文中雌核发育家系通过遗传灭活的鲈鱼精子诱导,冷休克阻止第二极体的排出实现染色体加倍。但是在减数分裂过程中由于同源染色体间可能发生交换,导致基因重组,因此减数分裂雌核发育二倍体后代中仍会出现部分杂合子。有关鱼类雌核发育群体基因重组的报道,重组率的变动范围较大。王晓清等对大黄鱼人工诱导雌核发育后代的微卫星标记进行了分析,两家系后代的基