基于傅里叶变换红外光谱的蚕豆病害鉴别研究

基于傅里叶变换红外光谱的蚕豆病害鉴别研究

农作物病害检测技术研究大豆属于植物科，属于蝴蝶科，属于野生豌豆和野生豌豆科。蚕豆适应冷凉气候、多种土地条件,是生物固氮之王,是种植结构调整中重要的间、套、轮作和养地作物,主要分布于南方秋播区和北方春播区。蚕豆可食用干籽粒,也可食用嫩籽粒,具有丰富的胆石碱、蛋白质,且不含胆固醇等,具有较高的经济价值和药用价值。蚕豆的产量和品质受到生产过程中许多生物和非生物胁迫因素的影响,导致植株产生生理性病害或生长异常。在我国的农业生产中,普遍存在着采用不恰当的盲目防治措施,随意使用农药现象,这影响了产品质量,与我国发展绿色农业、高效农业、精细农业的目标不相符。主要原因在于不能准确鉴别病虫害、以及判断危害程度。因此,加强蚕豆农作物病害的研究,对于蚕豆生产和提高品质具有重要意义。农作物病害的检测主要是大田采样后做常规生物学检测、光学显微镜和电子显微镜观察。传统生物学检测包括病原体分离、培养、接种鉴定等一系列过程;显微形貌观察也需经过固定、染色等较为复杂的过程,且需要丰富的识别经验;分子生物学手段也用于作物、植物病害鉴别,分子生物学方法虽然准确,但需经过一系列分离提取过程,操作繁琐,成本较高。近年来,光学成像、光谱学方法由于方便、快速,已用于农业生产的病虫害检测研究;近红外光谱、高光谱、多光谱成像技术在田间作物生长信息的快速获取、病虫害监测中显示较好的应用前景;而近红外光谱技术在农产品品质无损检测方面显示了一定优势。傅里叶变换红外光谱(FTIR)测量分子官能团的振动模式,具有指纹特性,已成为探测生物组织中的大分子的结构及相互作用的有力手段。红外光谱在中药鉴别、农产品检测等方面都得到了具体的应用,如山药的红外光谱鉴别研究、野生食用菌的红外光谱研究、病害烟叶的鉴别等。本工作基于FTIR并结合主成分分析(PCA)和聚类分析(HCA)对蚕豆病害叶进行鉴别研究。1实验部分1.1红外光谱分析实验使用德国Bruker公司的Tensor27型傅里叶变换红外光谱仪,测定范围为4000~400cm-1,装备DTGS检测器,分辨率为4cm-1,扫描次数16次。1.2红外光谱测试蚕豆叶采自云南大田,晾干,病害叶取病斑部位、正常叶取与病害叶对应相同部位测试。把干燥叶片样品磨细与适量KBr混合后研磨,压片后测试傅里叶变换红外光谱,测试45个叶片样品。使用光谱处理软件(OMNIC8.0)对所采集的红外光谱进行预处理,并利用统计软件(SPSS16.0)进行分析。2结果与讨论2.1结构振动及谱峰特征图1是蚕豆正常叶片、锈病、茎基腐病、轮纹病、黄化卷叶病的红外光谱图。可以看出,四种蚕豆病害叶和正常叶片样品的主要谱峰峰型相似,最强峰为羟基、NH伸缩区的3400cm-1附近宽峰。为了便于比较,将光谱分为4个区,K1区(3000~2800cm-1),主要有2926cm-1附近的CH2不对称伸缩振动和2854cm-1附近的CH2对称伸缩振动,K2区(1750~1500cm-1)显示了1739cm-1附近脂类C═O伸缩振动、1648cm-1附近酰胺Ⅰ中C=O的伸缩振动,以及1548cm-1附近酰胺Ⅱ的振动吸收,归属为N—H的弯曲振动和C—N的伸缩振动;K3区(1500~1200cm-1)主要是蛋白质、木质素、脂肪酸和多糖的混合振动吸收区,如在1440~1317cm-1附近的谱峰主要为蛋白质、纤维素、木质素中CH3和CH2受氧、氮原子影响时的对称弯曲振动吸收及CH3剪式振动吸收,K4区(1200~700cm-1)主要是多糖及其糖类异构体的吸收,1103和1055cm-1附近峰为碳水化合物(纤维素,半纤维素)中C—O和C—C伸缩振动,K4区包含了蚕豆叶片最明显的特征。在四个区中,强峰出现在K2区的1648cm-1附近,以及K4区的1103和1055cm-1附近。可以看出,蚕豆叶片的主要成分是多糖、蛋白质和脂类。2.2叶片蛋白质含量检测在3400cm-1附近,所有样品的吸收强度相近,但黄化卷叶病(图1e)的吸收峰变宽且波数略有变小;样品e在2926cm-1附近吸收增强而在2854cm-1附近吸收减弱;在1648cm-1附近,锈病(图1b)、茎基腐病(图1c)、轮纹病(图1d)的吸收比正常叶片的吸收略有增强,而e样品的吸收明显减弱;在1255cm-1处各图谱的谱峰峰型相似,吸收强度相近。通过光谱的吸收强度比A1255/A1648可以判断叶片中蛋白质含量的相对变化,正常叶片a对应吸收峰A1255/A1648>0.418,样品b,c和d对应吸收峰A1255/A1648<0.388,而样品e对应吸收峰A1255/A1648>0.569,表明细菌和真菌感染叶中蛋白质相对含量升高,而病毒感染叶样品中蛋白质的相对含量降低。在1055cm-1附近,样品b,c和d的吸收比正常叶片的吸收减弱,而样品e的吸收比正常叶片明显增强,可以通过原光谱的对应吸收峰A1055/A1255来确定样品中糖类相对含量的变化,正常叶片对应吸收峰A1055/A1255在2.092左右变动,样品b,c和d对应吸收峰强度比为1.485<A1055/A1255<1.873,而黄化卷叶病对应吸收峰强度比为2.489<A1055/A1255<3.188,表明细菌和真菌感染叶样品中糖类相对含量降低,而病毒感染叶样品中糖类的相对含量升高。2.3吸收峰的测定图1中,在多糖区1200~700cm-1光谱范围内,样品之间的光谱差异并不十分明显,由于导数光谱具有更高的分辨率,能够显示更多的分子信息,因此可以通过二阶导数光谱加以区别(见图2)。从图2可以看出,所有样品在1108,1073和918cm-1附近的吸收差异不明显,但其他峰各不相同,如在1175和1151cm-1附近,a,b和c都有两个吸收峰,而d只有一个吸收峰,e的吸收峰消失;在1052cm-1附近a和e的吸收较强,b和c的吸收减弱,d的吸收几乎消失;而在1016cm-1附近,a和e的吸收减弱,b,c和d的吸收增强;在988cm-1附近,a和e的吸收明显增强,b和c的吸收减弱,d的吸收消失;而在961cm-1附近,e的吸收减弱,b,c和d的吸收增强;在882cm-1附近,e的吸收情况正好相反,b和c吸收增强;在839cm-1附近,b和c的吸收增强,d的吸收减弱,e的吸收消失;在810cm-1附近e的吸收消失,而在778cm-1附近,e吸收明显。以上结果表明在多糖振动吸收区,病害叶片与正常叶片光谱差异较大,能够对病害样品进行鉴别。2.3.1同分度的比较通过计算相关系数来对样品进行相关分析,可以衡量变量之间线性相关程度的强弱,进而可以得到两样品之间的相似程度。在1200~700cm-1范围内利用以下公式对蚕豆二阶导数谱进行相关系数计算,其中r为相关系数,xi和yi是光谱x和y在频率i时所对应的吸光度,珚x和珔y为吸光度的平均值。相关分析结果显示,正常和正常叶片之间,同种病害样品之间的相关系数都在0.928以上,表明同种样品之间的化学成分相同或化学成分的相对含量相近。不同样品之间的相关系数各相差较大,如锈病和正常叶片的相关系数在0.650~0.885之间变动,茎基腐病与正常叶片之间的相关系数在0.850~0.915之间变动;轮纹病与正常叶片之间的相关度最低,在0.476~0.564之间变化;不同病害之间的相关度各不相同,如锈病和黄花卷叶病之间的相关系数在0.155~0.337之间变动。总体来说,病害叶片和正常叶片以及不同病害样品之间的相关系数各不相同,表明病害使蚕豆叶片的化学成分发生了改变或叶片中各成分的相对含量发生了变化。2.3.2聚成一类和聚成重视比采用欧氏距离平方和计算法对45个样品的二阶导数光谱在1200~700cm-1内进行聚类分析(见图3)。从图3中可以看出,所有样品共聚成5类,在距离5以内,C,D和E样品能够各自聚成一类。正常样品中,B7,E7和A5先聚成一小类,然后再和其他正常样品聚成一类;B样品的采集地不同,相同采集地的样品先聚成一类,然后不同采集地的样品在距离7以内再聚成一类;茎基腐病主要在植株的根部和颈部发病,叶片基本没有发生病变,叶片中各种化学成分或者各化学成分的相对百分含量和正常叶片相近,所以茎基腐病和正常叶片在距离10以内再次被聚成一类;在距离15处,细菌性病害和真菌性病害样品被聚成一类,而黄化卷叶病由于豆蚜或者斑潜蝇等害虫的危害或传播病毒引起的病毒性病害,单独聚成一类,但有2个正常叶样A10和A11被聚到此类中;最后在距离25处,所有样品聚成一类,45个样品聚类正确率达到73.3%。2.3.3各因素分析预测主成分分析不但能够降低数据维数,也能通过样本在各因子的空间得分确定所属类,新变量能够更加形象地表征原样本的品种区别、品质差异等。选择二阶导数光谱1200~700cm-1范围做主成分分析。主成分CP1的贡献率为72.97%,CP2的为16.12%,CP3的为3.56%,三个主成分贡献之和达到92.65%,因此选择此3个主成分能够对样品进行鉴别,结果如图4所示。从图4看出,CP1和CP3能够把锈病和轮纹病分开,但黄化卷叶病有两个样品被分在锈病一类中,CP2和CP3能够把正常叶片、茎基腐病和黄化卷叶病分开,而通过CP1,CP2和CP3能够把所有样品分成5大类,45个样品分类正确