蛋白水解物抗氧化活性及其抗氧化机制研究进展

蛋白水解物抗氧化活性及其抗氧化机制研究进展

在食品加工和储存过程中，氧化作用引起的质量不平等可能不亚于微生物腐败。风味、色泽以及营养成分下降等问题始终是食品品质提高的难点之一。由于食品是个复杂体系,大量的不饱和脂肪酸、蛋白质、风味成分、金属催化剂、氧化酶类、色素、维生素等成分以及加工过程采用的高温、高剪切、挤压、辐射、微波、干燥等加工和保藏手段,使食品非常容易发生氧化。而氧化会带来一系列的感官和营养问题,甚至产生有毒、有害物质,损害人体健康。为了控制食品中的各类氧化,人们发展了很多种抗氧化策略,其中利用抗氧化剂来抑制氧化反应成为最常用的方法。由于人工合成抗氧化剂,如BHA、BHT、TBHQ等可能存在潜在的健康风险,所以天然抗氧化剂,如植物提取物(茶多酚、迷迭香提取物等)、生育酚、抗坏血酸等在研究和工业界得到更多的重视。寻找更好的天然抗氧化剂成为食品及相关领域的一个热点问题。在过去的几十年中,研究发现肽和蛋白质水解物具有良好的抗氧化能力,并有可能成为新的抗氧化剂的来源,甚至是健康食品来源。这些来自于普通食品蛋白质的水解物,不仅在模拟体系中具有很强的抗氧化性,包括很强的自由基淬灭能力、还原能力以及金属离子螯合能力,而且在真实食品体系中,也表现出了很强的抗氧化效果。迄今为止,越来越多的不同来源的水解蛋白被发现具有一定的抗氧化能力,例如乳清、酪蛋白、蛋清蛋白、肌纤维蛋白、大豆蛋白、玉米蛋白、土豆蛋白、蛋黄、鳕鱼等等的水解物都具有一定的抗氧化性。随着越来越多的蛋白质水解物被发现具有抗氧化能力,抗氧化肽作为一种潜在的抗氧化剂成为可能。大量研究试图分离纯化并鉴定出具有最大活性的肽的序列,并探讨肽的结构与其功能的相关性,以阐明其抗氧化机制,促进具有强抗氧化能力的蛋白质水解物或者抗氧化肽的制造和应用。Suetsuna等研究表明,木瓜蛋白酶水解的酪蛋白水解物的抗氧化性来自于自由基淬灭能力,这些肽能够淬灭超氧化阴离子、氢过氧化物以及DPPH自由基。而酪蛋白磷酸肽(CPP)具有的抗氧化性来自于金属离子的螯合能力。Xiong等对乳清蛋白水解物抗氧化性肽的结构与功能相关性研究表明,水解物中的肽的相对分子质量以及组成决定了蛋白水解物的抗氧化能力。而Hernandez-Ledesma等认为,由于抗氧化肽的抗氧化特征不仅与其相对分子质量分布相关,而且与其结构特征特别是肽键形式相关,这导致相同氨基酸组成的不同肽的性质不同。另外有研究表明,抗氧化肽与食品组分中其它成分的相互作用会改变抗氧化肽的作用效果,例如与酚类化合物的协同作用将提高其效果,而与维生素C相互作用时,混合物体系中的部分肽可能起协同效果,另一部分可能起拮抗效果。以上研究结果说明抗氧化肽结构与功能,抗氧化肽在食品体系中的作用机制等还未到达明了的程度,对抗氧化肽的抗氧化性质、机制等的认识远远不足以支撑其为现实应用提供指导。抗氧化肽结构与功能之间是否存在相关性?抗氧化肽的工业应用是以蛋白水解物这样一种肽混合物状态出现的,肽的不同结构的混合体是否具有协同或者拮抗效应?抗氧化肽本身的稳定性如何?食品体系的复杂组分和食品加工条件的多样化对抗氧化肽是如何影响的?抗氧化肽本身被氧化后是否会起到促进体系氧化的效果?抗氧化肽进入人体后对人体的健康有什么作用?以上疑问说明进一步探讨蛋白质水解物抗氧化机制以及结构功能相关性,对于推进肽在食品复杂体系中的作用机制的认识,具有很好的意义,同时对于推进抗氧化肽的制造和应用也具有极大的意义。1蛋白质水解物的抗氧化能力研究抗氧化剂的抗氧化活性测定主要有两大类:以食品抗氧化为主要目标的体外抗氧化活性以及在人体中的生物活性。对于蛋白水解物而言,体外抗氧化活性比较常见的有3类:通过测定样品抑制脂类物质氧化的能力来评定被测物的抗氧化能力,用样品对人工生成的自由基的清除能力来反映待测物的抗氧化活性以及基于还原力或者金属离子螯合能力等辅助抗氧化能力的测定方法。体内抗氧化活性由于周期长,实验繁琐,在蛋白水解物的抗氧化活性测定中很少采用。蛋白质水解物抑制脂类物质氧化能力通常有硫氰酸铁法(ferricthioeyanatemethod,FTC)、硫代巴比妥酸法(thiobarbituricacid,TBA)及直接测定法等,见表1。以清除自由基为基础的方法主要有:淬灭DPPH·、ABTS·+、羟自由基、超氧阴离子、ORAC法(oxygenradicalabsorbancecapacity)、TRAP(totalperoxylradical-trappingantioxidantparameterassay)法和电子自旋共振法(ESR)等,具体指标及原理见表2。除了上述方法外,基于还原力或者金属离子螯合能力等辅助抗氧化能力的测定方法也比较常见,主要有还原力法及FRAP,Cu2+、Fe2+等金属离子螯合能力等。尽管抗氧化性测定方法很多,但是由于各种方法在反应机理、氧化诱导剂、目标/探针、反应条件以及结果的表示方法等方面各不相同,因此,抗氧化能力结果之间很难比较。即使采用同一种方法,由于抗氧化标样、溶剂、反应时间以及pH等条件有可能不同,致使研究结果之间难以比较。除了抗氧化能力测定方法之间较难比较外,由于蛋白质水解物本身的抗氧化机制也比较复杂,可能兼有自由基淬灭、螯合金属离子、还原能力甚至单线态氧淬灭能力等,而且蛋白水解物本身为混合物,可变因素很多,因此在研究蛋白质水解物的抗氧化能力时,单独使用一种方法测定水解物的抗氧化性,很难得到满意的结果。对于这样的体系,采用多种方法联合测试,可能更有利于阐明水解物的抗氧化特征。2氨基酸残基的肽段抗氧化能力通常来说,抗氧化剂抑制或者延缓氧化主要有两种方式:一是淬灭自由基,如酚类物质;二是不直接淬灭自由基,通过各种途径,如螯合金属离子;清除氧气,将氢过氧化物转变成非自由基成分;通过紫外光线吸收或者单线态氧淬灭的方式进行抗氧化。前者有时被称为初级抗氧化剂,后者被称为次级抗氧化剂。一般而言,后者的抗氧化作用的发挥需要在上述氧化引发条件存在的情况下才能起作用。比如,柠檬酸只有在金属离子存在的条件下才发挥作用。另外,不同结构的抗氧化剂的抗氧化机制也不同。以淬灭自由基为例,大部分初级抗氧化剂的作用原理是与脂游离基发生反应,形成不活泼的物质,比如与脂过氧化物降解形成的过氧化物自由基或者烷氧化物自由基反应。有一些抑制剂是通过稳定氢过氧化物以防止进一步生成自由基而达到抗氧化效果。还有一些氧化抑制剂通过形成非活泼基团的方式降解脂过氧化物,从而起到降低游离基的效果。对抗氧化肽的抗氧化机制的探索,也是从上述途径着手。研究显示,含有酪氨酸、苯丙氨酸的二肽都具有很强的自由基淬灭能力。Guo等合成了12种含有2~4氨基酸残基的肽段(Ala-Leu,Phe-Lys,Phe-Arg,Ile-Arg,Lys-Phe,Lys-Leu,Lys-Tyr,Arg-Tyr,Tyr-Asp,Tyr-Tyr,Leu-Asp-Arg,Lys-Asn-Tyr-Pro),并采用羟基自由基淬灭、过氧化氢淬灭、金属离子螯合能力及超氧阴离子淬灭能力4种方法探究上述肽的抗氧化能力,结果显示,这12个肽之间超氧阴离子淬灭能力和金属离子螯合能力几乎无差别。另外,这些肽都具有很强的羟基自由基淬灭能力,其中在C端含有酪氨酸的3种二肽(Lys-Tyr,Arg-Tyr,Tyr-Tyr)显示出了较强的羟基自由基淬灭能力。而在N端含有赖氨酸的小肽(Lys-Phe,Lys-Leu,Lys-Tyr,LysAsn-Tyr-Pro)以及肽序中含有酪氨酸残基的肽(Arg-Tyr,Tyr-Asp,Tyr-Tyr)对亚油酸的过氧化都显示出很强的抑制能力。作者还发现,在N端含有苯丙氨酸的二肽(Phe-Lys,Phe-Arg)也显示出对亚油酸的过氧化有很强抑制能力,并对羟基自由基有淬灭能力。因此,Guo等认为上述12种结构的肽段的抗氧化能力来自于自由基淬灭能力的联合效应。Kitts等综述了酪蛋白磷酸肽(CPP)的抗氧化性,他们认为CPP在水溶液和乳状液体系中既具有淬灭自由基能力又具有螯合二价铁离子能力。随后,Kim等也证实这个推断,他们发现,CPP对过氧自由基的淬灭能力与其还原能力呈正相关。肌肽(β-alanyl-L-histidine)的抗氧化能力被认为来自于对铜离子的螯合能力或者羟基自由基淬灭能力。Aruoma等人的报道显示,肌肽和鹅肌肽(N-beta-alanyl-3-methyl-L-histidine)仅对羟自由基有良好的淬灭能力,而对超氧阴离子以及过氧化氢则活性很低。肽的金属离子螯合能力也被认为是肽抗氧化能力的一个来源,一些酸性或者碱性的氨基酸侧链在螯合金属离子方面扮演重要角色。Zhang等发现肌肉蛋白水解物具有良好的Cu和Fe离子螯合能力。Zhu等发现玉米蛋白水解物具有良好的Fe离子螯合能力。Chen等合成了22种肽,发现这些肽金属离子螯合能力(Cu2+、Zn2+)都很强。Cheng等等研究了马铃薯蛋白水解物在乳状液中的抗氧化能力,结果显示,马铃薯蛋白水解物中低分子质量组分(<1043Da)和极性较弱组分表现出较好的清除ABTS活性和抑制大豆油O/W乳状液中油脂氧化的能力。将油-水界面上的马铃薯蛋白水解物进行分离纯化,并利用质谱检索界面上蛋白的组成和结构,结果显示分布在油-水界面上的具有高抗氧化能力的多肽大多是由2~7个氨基酸组成的短肽,其相对分子质量在200~800之间,而在氨基酸组成上,这些多肽表现一定的亲水疏水平衡性,且亮氨酸、脯氨酸、赖氨酸和精氨酸出现的概率较高。这些多肽中高比例的碱性氨基酸含量暗示在脂肪球界面双电层的内层可能表现为净的正电荷,这有利于排斥促氧化的金属离子对油脂的作用。作者利用Zeta电位印证了这个结果。根据上述结果,作者推断马铃薯蛋白水解物在乳状液中对油脂氧化的抑制作用不仅与其本身的抗氧化能力相关,也与其在乳状液油-水界面的物理屏障作用有关。3含组氨酸的肽结构表征迄今为止,有很多研究从不同的蛋白质水解物中分离纯化获得近百个具有抗氧化能力的纯的肽段,尤其是含有组氨酸、脯氨酸、酪氨酸和亮氨酸的肽段,具有很强的抗氧化能力。前人研究已经证实,组氨酸具有抗氧化性,这种抗氧化能力来自于咪唑环,咪唑环可以干扰由金属离子引发氧化-还原反应导致的羟基自由基,还可以与单线态氧直接作用;酪氨酸及色氨酸的抗氧化能力则来自于其结构上的酚羟基以及吲哚基结构,它们可以作为氢供体,因此含有组氨酸、酪氨酸等本身有抗氧化能力的肽具有强抗氧化性,比较容易理解。很多氨基酸单独存在时抗氧化能力并不显著,但是他们结合在一起时却具有良好的抗氧化能力。因此抗氧化肽的结构与其功能究竟是怎样的?这个疑问引发了大量的研究。Chen等发现组氨酸在抗氧化肽中的位置以及构象对肽的抗氧化能力有着巨大影响。Chen等从大豆蛋白7S的水解物中发现并鉴定了6种具有较强抗氧化性的肽(Val-Asn-Pro-His-Asp-His-Gln-Asn,Leu-Val-Asn-Pro-HisAsp-His-Gln-Asn,Leu-Leu-Pro-His-His,LeuLeu-Pro-His-His-Ala-Asp-Ala-Asp-Tyr,Val-IlePro-Ala-Gly-Tyr-Pro,和Leu-Gln-Ser-Gly-AspAla-Leu-Arg-Val-Pro-Ser-Gly-Thr-Thr-TyrTyr),这些肽分别含有5~16个氨基酸残基,具有几乎相同的特征,即都含有疏水性氨基酸缬氨酸和亮氨酸,并且N端的氨基酸为脯氨酸、组氨酸或者酪氨酸。据此,作者认为,上述结构肽的抗氧化性可能基于金属离子螯合能力或者自由基淬灭能力。为了进一步研究上述氨基酸残基在抗氧化性质中的作用,Chen等以从大豆蛋白7S的水解物中分离获得的天然抗氧化肽Leu-Leu-Pro-HisHis为基础,合成了28个序列结构和长短不同的肽;以铁硫氰酸方法研究了28种合成肽在水溶液体系中对亚油酸过氧化的抑制能力。研究结果显示,在所有28中肽序列中,Pro-His-His的抗氧化活性最强,C端组氨酸的删除会减弱肽的抗氧化性,而N端亮氨酸的删除对活性没有影响,但是如果在Pro-His-His的两个组氨酸之间插入亮氨酸或脯氨酸,对肽的抗氧化性无显著影响。由此,作者认为在肽序中,组氨酸或脯氨酸对于抗氧化活性有着重要意义。另外,研究还显示,肽的序列对抗氧化活性有非常显著的影响,将HHPL或LH序列转为HHLP或HL结构,两者的活性都显著下降;而且肽的构象对活性也有巨大影响,将Pro-His-His结构中第二位的His用D-His取代,肽段的抗氧化性显著下降。基于上述结果,作者认为咪唑基的位置对于肽的抗氧化性而言具有重要意义。为了进一步证实组氨酸在肽的抗氧化性质中的作用机制,Chen等对上述28中肽中含有组氨酸的22种肽采用多种抗氧化性的测定方法,包括自由基淬灭(DPPH,超氧阴离子)、金属离子螯合能力(Cu2+、Zn2+)、单线态氧淬灭能力,以及分别由AAPH和AMVN诱导的亚油酸氧化的抑制能力等,以评估上述22种含有组氨酸的肽的抗氧化性能。结果显示,尽管含有组氨酸的肽段显示了具有单线态氧的淬灭能力,但是其对AAPH和AMVN诱导的亚油酸氧化没有抑制能力,也没有显示具有显著的超氧阴离子淬灭能力。另外,金属离子螯合能力与肽的疏水性与其抗氧化能力之间没有显著的相关性。Chen等人对含组氨酸的肽结构功能的研究表明,含有组氨酸的肽既有金属离子螯合能力又有单线态氧淬灭能力和羟基自由基淬灭能力。尽管这些特征单独而言都与肽的抗氧化性不成线性关系,但是肽的总体抗氧化能力可能来自于这些性质的协作。酪氨酸和甲硫氨酸是含这两种氨基酸的肽的抗氧化核心部位。Elias等人把beta-乳球蛋白的胰蛋白酶水解物作为抗氧化剂,加入Brij稳定的乳状液中,并测定蛋白水解物中两个多肽DIQK-VAGTWY、SLAMAASDISLL上酪氨酸和甲硫氨酸在储藏过程中的氧化情况,结果表明,随着储藏过程中油脂氧化的抑制,这两个肽中的酪氨酸和甲硫氨酸自身发生了氧化。含有酪氨酸的短肽中,相邻的氨基酸结构及肽所处的环境对肽的抗氧化性有显著影响。Zhang等研究了tyrosine,N-acetyltyrosine,Gly-Tyr,Glu-Tyr,Tyr-Arg,Lys-Tyr-Lys这些结构相似且都含有酪氨酸的二肽和三肽的抗氧化性,结果显示,对于光催化氧化,带有正电荷的基团连接在酪氨酸上,在光催化氧化条件下,促进含有酪氨酸的短肽的氧化;连接中性或者酸性氨基酸,会降低肽的氧化速率;但是对于金属催化氧化正好相反。氨基酸序列、肽键本身以及肽的构象可能对肽的抗氧化性有显著影响。Chan等利用电子自旋共振研究了肌肽及相关的含组氨酸的二肽的自由基淬灭能力,结果显示,组氨酸及含有组氨酸的二肽都可以淬灭由Fe2+和H2O2诱导的羟基自由基,淬灭活性β-Ala<Gly<His<肌肽<Gly-His;而这些氨基酸或二肽抑制由羟基自由基诱导的卵磷脂脂质体的氧化时,活性顺序有所改变,即:β-Ala<Gly<Gly-His<His<肌肽,这些结果暗示二肽对于羟基自由基的淬灭能力及抗氧化活性取决于肽键的形成以及氨基酸在肽中的位置。Hernandez-Ledesma等的研究结果也进一步印证了这个结果,作者利用corolasePP水解β-乳球蛋白,得到了一系列具有潜在抗氧化能力肽段序列。为了验证这些肽段的抗氧化性,作者合成了其中3个序列,结果发现Trp-Tyr-Ser-Leu-Ala-Met-AlaAla-Ser-Asp-Ile序列的自由基淬灭能力(ORAC-FL值)尽管比植物来源的香豆酸和五羟黄酮分别低1.7和4倍,却高于人工合成抗氧化剂BHA。为了判断上述肽段序列中氨基酸的作用,作者将组成肽段的氨基酸按构成肽的比例混合,结果发现相同摩尔质量的氨基酸混合物的抗氧化能力显著高于肽。而另外两个序列Met-His-Ile-Arg-Leu和Tyr-Val-Glu-Glu-Leu与Trp-Tyr-Ser-Leu-AlaMet-Ala-Ala-Ser-Asp-Ile相比,其自由基淬灭能力显著降低,但是有趣的是,上述两个肽与组成序列的等摩尔氨基酸混合物相比,肽的抗氧化性高于氨基酸混合物,这个结果与Trp-Tyr-Ser-LeuAla-Met-Ala-Ala-Ser-Asp-Ile序列的结果相反。这个结果也意味着氨基酸序列、肽键本身以及肽的构象可能对肽的抗氧化性有显著影响。一些特殊结构组合对于肽的抗氧化特点而言具有特别的意义。Suetsuna等发现Glu-Leu结构在抗氧化活性中具有重要意义,作者以酪蛋白水解物中分离获得具有超氧阴离子淬灭能力的一个肽段Tyr-Phe-Tyr-Pro-Glu-Leu为模板,从C端逐步删掉氨基酸,合成了一系列结构类似体———Phe-Tyr-Pro-Glu-Leu,Tyr-Pro-Glu-Leu,ProGlu-Leu,Glu-Leu,并将6种氨基酸直接混合(Tyr+Phe+Tyr+Pro+Glu+Leu),测定上述肽及氨基酸混合物的超氧阴离子淬灭能力,结果显示,在Tyr-Phe-Tyr-Pro-Glu-Leu的C端删除Tyr,TyrPhe和Tyr-Phe-Tyr,都会引起肽的超氧阴离子淬灭能力下降,但是Glu-Leu结构显示出比TyrPhe-Tyr-Pro-Glu-Leu更强的淬灭能力。然而,6种氨基酸直接混合几乎不显示超氧阴离子淬灭能力。这个结果暗示Glu-Leu结构在抗氧化活性中具有重要意义。关于肽的亲疏水性、相对分子质量以及肽段中携带的氨基酸的电性或者酸碱性等对肽的抗氧化性的影响,在不同的蛋白水解物体系、不同抗氧化性测定方法方面等都有不同的结论。很多研究报道如果肽段中带有碱性氨基酸、芳香环或者疏水氨基酸,例如组氨酸、赖氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸等可能具有良好的抗氧化性。例如Tang等报道了Acalase水解的玉米蛋白水解物中Tyr-Ala和Leu-Met-Cys-His具有良好的ABTS自由基抑制能力。Cheng等报道了利用Acalase水解的土豆蛋白水解物中Ser-Ser-GlyPhe-Thr-Tyr,Ile-Tyr-Leu-Gly-Gln,Thr-Tyr,Tyr-Phe-Glu,Tyr-Ser-Thr-Ala和Asn-Tyr-LysGln-Met的ABTS自由基抑制能力很强。WonKyoJung等报道用发酵法获得蓝色贻贝(Bluemussel)的水解产物中Phe-Gly-His-Pro-Tyr肽段具有很强的羟基自由基淬灭能力。Suetsuna等在酪蛋白的木瓜蛋白酶水解物中分离鉴定出TyrPhe-Tyr-Pro-Glu-Leu肽段,其超氧阴离子和DPPH自由基淬灭能力都很强。上述肽段都有比较明显的特征,即含有大量的酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸或者色氨酸。但是Saiga等利用木瓜蛋白酶水解猪肌纤维蛋白获得一系列肽段,包括ValPro-Ser-Ile-Asp-Asp-Gln-Glu-Glu-Leu-Met,Glu-Glu-Leu-Asp-Asn-Ala-Leu-Asn,Ile-GluAla-Glu-Gly-Glu,Asp-Ala-Gln-Glu-Lys-LeuGlu和Asp-Ser-Gly-Val-Thr等含有大量的酸性氨基酸,这些肽段中既无组氨酸也无酪氨酸,但是它们也具有良好的还原力。作者推测,这些带有酸性氨基酸的肽段的抗氧化能力可能来自于酸性氨基酸的金属离子螯合能力。很多模型被用于分析抗氧化肽结构与功能的相关性,例如相关性分析、多元线性回归分析、主成分分析法、判别分析等。这些分析方法对以肽段大小、亲疏水性、氨基酸组成等角度分析结构与功能相关性等方面,起着一定的作用。尽管具有抗氧化能力的肽段结构不断被发现,抗氧化肽的结构与功能之间的关系也在不断探索中,但是目前除了肌肽和谷胱甘肽以外,蛋白质水解物或者其它抗氧化肽结构与功能相关性远未达到明了的程度。4其它氧化酶的相互作用如前所述,越来越多的蛋白质水解物被发现具有抗氧化能力,很多结构明确的抗氧化肽的自由基淬灭能力,对油脂的抗氧化能力,对金属离子的螯合能力,甚至不弱于人工抗氧化剂BHA等,因此抗氧化肽作为一种潜在的抗氧化剂应用于食品及相关领域成为可能。但是迄今为止除了肌肽、谷胱甘肽等传统的具有强抗氧化性的肽已经应用于医药、食品、保健品及饲料外,其它抗氧化肽,特别是具有抗氧化能力的蛋白水解物除了个别用于保健品外,大都仍在研究之中。为了推进抗氧化肽的应用,一些研究开始着重探索抗氧化肽与食品中其它成分以及其它抗氧化剂如酚类化合物、BHA、BHT及植物提取物等的相互作用。大量研究显示,蛋白水解物与酚类成分有协同效应。Bishov等早在1972年就发现植物蛋白和酵母蛋白水