锂-匹罗卡品颞叶癫痫大鼠的早期死亡行为

锂-匹罗卡品颞叶癫痫大鼠的早期死亡行为

氯化铝-多酚鲁酯的点燃大鼠癫痫模型具有相似的人类癫痫可持续状态（se）或叶癫痫的特征。病理学研究证实匹罗卡品致痫能诱发海马门区神经元死亡及苔藓出芽,类似于人类颞叶癫痫的临床及病理特征,是理想的颞叶癫痫模型,适用于探讨颞叶癫痫形成机理及筛选抗癫痫药物,用于SE及复杂部分性发作的分子生物学和电生理等多方面研究。我们对这一模型制作的稳定性、重复性及致痫大鼠早期死亡原因,作了进一步的探讨及研究。数据和方法1.实验前适应饲养SPF级健康成年雄性Wistar大鼠60只,体重170～200g,由南方医科大学实验动物中心提供(合格证号0050669),由广州军区广州总医院动物实验中心饲养。实验前适应性饲养一周,观察无自发性癫痫发作入选。所有大鼠随意饮水、进食,保持12h白昼及12h黑夜的周期环境。2.水、糖、甲醛等为酰氯醛、五%葡萄糖钠溶液氯化锂(溶于生理盐水,美国Sigma公司)、匹罗卡品(溶于生理盐水,日本WakoPureChemican)、硫酸阿托品(1ml∶0.5mg)、地西泮注射液(2ml∶10mg)、10%水合氯醛、5%葡萄糖氯化钠溶液;多功能神经电生理监测仪(美国AXON)、电子分析天平等。3.小鼠癫痫发作试验根据SPSS统计软件产生随机数字后,将60只大鼠随机分为生理盐水对照组10只、癫痫模型组50只。氯化锂127mg/kg腹腔注射,18～24小时后给予硫酸阿托品1mg/kg腹腔注射,30min后首剂腹腔注射匹罗卡品30mg/kg,30分钟后如无Ⅳ级以上发作,可每隔15分钟注射10mg/kg追加剂量,直至出现Ⅳ级以上无明显间歇的SE,每只大鼠总量不超过50mg/kg。SE后l小时,腹腔注射地西泮10mg/kg终止SE以降低死亡率,如效果不佳可于30min后再注射1次。对照组予以相同体积的生理盐水腹腔注射。大鼠癫痫发作症状采用Racine(1972年)分级标准:0级:无任何反应;Ⅰ级:面部阵挛,包括眨眼、动须、节奏性咀嚼等;Ⅱ级:Ⅰ级加节律性点头;Ⅲ级:Ⅱ级加前肢肌阵挛,但无后肢直立位;Ⅳ级:Ⅲ级加后肢直立位;Ⅴ级:全面性强直-阵挛发作,并失去体位控制。点燃出现RacineⅣ级以上并存活者入组。SE后1周内,每天给予5%葡萄糖氯化钠3～5ml腹腔注射,2次/天,加强能量供给。结果1.racine模型腹腔注射氯化锂未见RacineⅢ级或以上癫痫发作症状。首次注射匹罗卡品30mg/kg未出现RacineⅣ级或以上者12只(24%);第一次追加匹罗卡品10mg/kg,上诉未达标中5只出现RacineⅣ级或以上癫痫发作症状;第二次追加匹罗卡品10mg/kg,剩余未达标中3只出现RacineⅣ级或以上癫痫发作症状。造模过程中症状Racine分级统计,其中Ⅰ级3只(3/50),Ⅱ级4只(4/50),Ⅲ级5只(5/50),Ⅳ级16只(16/50),Ⅴ级22只(22/50)。癫痫模型组点燃最后出现RacineⅣ级以上者46只(92%)。生理盐水对照组动物无任何抽搐发作迹象。造模时模型组的38只大鼠在注射皮罗卡品后5min左右开始出现动作僵硬及刻板等,10min左右出现“洗脸”、点头、“湿狗样”抖动等面部动作,15～20min逐渐出现直立、跌倒、竖尾,甚至跳跃,发作逐渐由上肢延及下肢,以至于全身的强直阵挛发作,最终在30min左右导致SE产生。另有流涎、流泪、结膜充血、大汗、瞳孔缩小、腹泻等外周胆碱能兴奋表现,4～7天后所有入组未死亡大鼠均出现自发性癫发作。SE后l小时,所有致痫大鼠均给予腹腔注射地西泮10mg/kg,其中25只终止SE,余致痫大鼠30min后再次给予腹腔注射地西泮10mg/kg,仍有2只未终止SE并于第二个30min内死亡。2.模型大鼠沙棘波的发放生理盐水对照组为正常EEG,频率为16.25～27.86Hz,波幅15.3～50μV,无性波发放。造模时注射皮罗卡品后,症状未出现SE或评分未达RacineⅣ～Ⅴ级的大鼠EEG也无性波发放,但脑电波普遍慢化,波幅增高。模型组大鼠棘波发放在SE后25.64±9.07min左右出现,最大频率28Hz,最高波幅150μV;SE停止后,EEG的高频率、高波幅棘波仍可持续8.54±0.68h左右,点燃SE后的第1、3天EEG未发现痫性波,但背景波频率变慢,第1天的波幅较高,第7天后EEG监测均出现周期性样放电。3.周1月至5月se期①SE期0～6小时期间内死亡6只;7～12小时期间内死亡3只;13～24小时期间内死亡1只。SE期死亡率为21.74%(10/46)。②静默期第2天及第4天分别死亡1只。静默期死亡率为4.35%(2/46)。③慢性期无致痫大鼠死亡。总死亡率为26.09%(12/46)。4.脑表面明显,脑切实有张力癫痫模型组SE期致痫大鼠死亡后立即行颅脑及肺部解剖。大鼠颅脑解剖见脑脊液明显减少,全脑组织肿胀,以前脑明显,脑表面为灰白色,脑切面湿润质软。脑组织切片光镜下所见脑血管扩张充血及轻-中度的脑水肿。肺部解剖见气管大量分泌物,胸腔积血积液,肺组织肉眼可见肺表面湿润,有散在出血点。病理切片见肺间质毛细血管扩张、充血,肺间质和肺泡腔内可见含蛋白液体渗出,提示肺水肿。氯化锂-匹罗卡品致痫模型的合成锂-匹罗卡品大鼠模型是Honchar等1983年在Science杂志上首次报道,此模型致痫鼠可出现SRS,且可导致海马结构易损区的特异性损伤,被认为是具有与人类颞叶癫痫相似特征的致痫鼠模型,该模型使用匹罗卡品的量较大剂量匹罗卡品模型用量大大减少,降低了匹罗卡品的毒副作用所造成的高死亡率,同时增加了SE的诱发率,是近年来国外应用较多的一种公认的边缘系统癫痫模型。锂-匹罗卡品致痫模型的机制尚不十分清楚。Cavalheiro认为氯化锂和匹罗卡品所致癫痫模型中,神经元损伤部位主要位于前脑,包括海马、齿状回、梨状皮层等区;而在丘脑、嗅结节、新皮层、黑质、杏仁核等处也可观察到有神经细胞的缺失。匹罗卡品是乙酰胆碱M受体激动剂,乙酰胆碱是脑内主要的兴奋性神经递质,引起持续性的全身强直-阵挛发作。Voutsinos-Porche等认为氯化锂的作用机制是通过抑制肌醇单磷酸酶,导致循环降解产物第二信使IP3和DG可利用度降低及脑内肌醇水平,与匹罗卡品有协同作用,预先应用氯化锂注射,可降低匹罗卡品诱发痫性发作的阈值而减少匹罗卡品剂量进而减少其毒副作用,降低致痫动物的死亡率。本研究在氯化锂-匹罗卡品颞叶癫痫模型的基础上对匹罗卡品的用法及致痫大鼠SE后的对症处理做了一些改进,匹罗卡品30min后如无Ⅳ以上痫性发作,继续给予10mgPkg匹罗卡品注射,每隔30min追加一次,自到出现SE为止。为保证实验条件的均一性,每只大鼠总量不超过50mgPkg。在配置配置匹罗卡品溶液发现配置匹罗卡品的浓度不能过低,若浓度过低会导致匹罗卡品剂量增加,可能是由于短时间不能达到较高的血药浓度而不能发挥其致SE的作用。SE肢体剧烈抽搐造成能量及体液消耗,以及外周胆碱能受体M样作用所致的消化液和汗液过量分泌,使大鼠极易休克,出现对外界无反应状态,绝食水,因而SE期后毒性阶段致痫鼠死亡多因营养耗竭。因而本研究在SE后1周给予腹腔注射糖盐加强营养,与文献报道相比,以上改进既增加了SE诱发率又降低了死亡率。在本组实验中,注射氯化锂-匹罗卡品后,癫痫模型组点燃最后出现RacineⅣ级以上者46只(92%),癫痫模型点燃后总死亡率为26.09%(12/46),其中SE期死亡率为21.74%(10/46)。说明锂-匹罗卡品颞叶癫痫模型致痫成功率高,致痫后总体死亡率不高,且主要集中于SE期。分析原因:①腹腔注射匹罗卡品前30min给予硫酸阿托品1mg/kg腹腔注射,虽然能有效地减轻匹罗卡品本身导致的外周胆碱能效应,对减少腺体分泌,缓解支气管痉挛,改善呼吸极为重要。然而虽然地西泮静脉注射是临床抢救癫痫现场发作的首选药物,而在本模型抗癫痫作用并不理想,第一次腹腔注射后终止SE率仅为54.35%(25/46),追加剂量后仍有2只致痫大鼠未能终止SE并于第二个30分钟内死亡。就其原因除与在本模型中,地西泮采用腹腔注射,导致油剂吸收缓慢而不规则外,地西泮可能使大鼠吞咽、呛咳反射减弱或消失,呼吸道分泌增多,加重匹罗卡品本身导致的胆碱能效应,使支气管痉挛和腺体分泌增加,气道阻塞进一步加重,引起肺水肿,进而导致脑缺血缺氧,引起全脑水肿,导致致痫大鼠死亡。死亡大鼠经解剖证实均存在急性肺水肿及脑水肿即是最好证明。②本研究在SE后1周给予腹腔注射糖盐加强营养,有效地减轻毒性阶段因厌倦不动、不进食物及饮水、体重减轻、脱水等导