锂-匹罗卡品诱导的植物生长调节剂在颞叶癫痫模型中的应用

锂-匹罗卡品诱导的植物生长调节剂在颞叶癫痫模型中的应用

癫痫（ep）是神经系统的第二病，具有复发性神经元异常痉挛和复发性脑瘫功能异常的特点，是最常见的难治性ep。由于临床研究困难、发病机制复杂,因此构建动物模型是最行之有效的研究方法。为此,我们建立锂-匹罗卡品小鼠EP模型,观察其行为学改变,并且应用ZnSe金属自显影技术(AMG)检测苔藓纤维出芽情况,以探讨其有无类似于人类颞叶EP的行为学及病理学特征。1材料和方法1.1模型小鼠行为检测雄性CD-1小鼠35只,体重18-22g,由中国医科大学实验动物部提供。分笼饲养,常规饮食。随机分为对照组5只和模型组30只,后者又分3d、7d、15d、30d、60d五个时间点,每个时间点6只小鼠。锂-匹罗卡品模型组小鼠首先经腹腔注射氯化锂(0.13g/kg),18~24h后注射硫酸阿托品(1mg/kg),30min后再注射匹罗卡品(150mg/kg)。给药小鼠在15~30min后出现反复强直-阵挛发作,即癫痫持续状态(statusepilepticus,SE)。于SE后90min,腹腔注射地西泮(10mg/kg),终止SE,降低死亡率。观察小鼠行为变化。对照组小鼠腹腔注射生理盐水,余同实验组。1.2根据语言分级标准作小鼠在腹腔注射匹罗卡品后观察其行为学变化,参考Simialowski6级(0-V)评定法。0级:无任何发作迹象;Ⅰ级:凝视,头面部轻微颤动;Ⅱ级:点头或WDS(湿狗样抖动)、搔抓;Ⅲ级:前肢局限性惊厥;Ⅳ级:具有后肢站立的全身强直性惊厥;Ⅴ级:具有站立伴摔倒全身强直一阵挛性发作。连续3次以上出现4~5级发作,即被认为达到SE。1.3动物标本的采集小鼠在腹腔注射致SE后,在不同时间点(3d、7d、15d、30d、60d)对实验组及对照组动物进行取材。动物首先经腹腔注射0.1%硒酸钠(15mg/kg),存活1.5h后腹腔注射4%戊巴比妥钠麻醉动物,然后用蠕动泵经左心室灌注生理盐水和2.5%戊二醛150ml,取大脑,2.5%戊二醛后固定3h。标本置于30%蔗糖液4℃冰箱保存过夜。恒冷箱制备10μm的冰冻切片,切片置于AMG孵育液并在恒温(26℃)振动水浴箱内孵育60min,封片后,X在光镜观察。2结果2.1小鼠癫痫发作的一般情况SE模型行为学改变主要分3期。急性期:腹腔注射15-30min后,小鼠出现凝视、湿狗样震颤、眼裂变大、双眼球突出、阵发性头面部轻微颤动、节律性点头、双侧前肢局限性惊厥、可伴口中流涎。随时间延长,小鼠可出现发作性剧烈狂奔、跳跃、跌倒,并出现伴后肢站立甚至站立后摔倒的全身强直性惊厥发作。发作时头部后仰、全身肌肉剧烈抽搐、四肢强直、尾部上翘、口吐白沫,持续约1分钟。最终反复发作达到SE。潜伏期:在SE后2~14d为潜伏期,主要表现为精神萎靡、进食活动少、消瘦,但无癫痫自发发作表现。慢性期:在SE后15~60d为慢性期,小鼠出现癫痫的反复自发发作,最初多为局部性发作如前肢阵挛或面部抽搐,很快发展至全身强直性惊厥发作,一般持续时间不超过1min,发作均可自行终止。生理盐水组未见发作。2.2小鼠偶见少数苔藓纤维进入内分子层正常生理盐水对照组、SE后3d的小鼠海马齿状回内分子层未见到AMG染色的棕黑色颗粒(图1-4);SE后7d的小鼠偶可见少数苔藓纤维穿过颗粒细胞层进入内分子层(图5、6);SE后15d、30d及60d的小鼠可见大量苔藓纤维穿过齿状回颗粒细胞层到达内分子层,并逐渐在此处形成一条深染的致密层状带(图7-12)。3纤维出芽动力学改变匹罗卡品是胆碱能毒蕈碱类受体激动剂,能激发脑内乙酰胆碱能受体,激活谷氨酸兴奋通路诱发SE,导致海马等易损区的兴奋毒性损害;此外,匹罗卡品能激活NMDA受体、代谢性谷氨酸受体,从而激活了脑内兴奋性系统,出现了EP的发作。而氯化锂对匹罗卡品的致痫过程有协同作用,可减少匹罗卡品的用量,减轻其毒副作用,降低致痫小鼠的死亡率。因此本研究联合应用氯化锂、匹罗卡品作为造模药物,而且成功诱导了小鼠出现SE发作。合格的EP动物模型首先要具有与人类颞叶EP相似的临床特点即:EP发作时出现典型的行为学改变;在脑部受损伤后,在出现临床自发性EP症状之前存在一个潜伏期,可数天、数月或数年。本研究中发现,在腹腔注射匹罗卡品后,小鼠的行为学改变急性期表现为典型的EP发作症状,最初为1-3级,如双侧前肢局限性惊厥等,之后发作级别逐渐上升,直至出现SE造成脑损伤。在SE后2~14d进入潜伏期,表现为精神萎靡、但无EP自发发作表现。在SE后15~60d进入慢性期,小鼠出现反复EP自发发作,一般持续时间不超过1min,发作均可自行终止。这些行为学改变与已往的大鼠EP模型的研究结果一致,与人类颞叶EP极其相似。苔藓纤维出芽是人类颞叶EP的典型病理学特点。苔藓纤维(MF)是海马齿状回颗粒细胞的轴突。正常情况下,MF与门区中间神经元及CA3区锥体细胞的树突建立神经联系;当CA3区锥体细胞和门区神经元被致痫损伤后,内分子层失神经传入,MF也与靶细胞断离,因而触发MF异常出芽回返入内分子层并与该层颗粒细胞的树突建立异位突触。本研究中也发现,在SE后3天及7天时,海马齿状回内分子层未见明显的苔藓纤维出芽,从第15天开始,海马齿状回内分子层有明显的苔藓纤维出芽,到30天及60天时出芽更加明显,而对照组却未见苔藓纤维出芽。这与Sankar等的研究结果相符,证实了该模型Figs.Nomossyfibersproutingwasobserved(1,2)intheinnermolecularlayerincontrolandon3thdayafterinjectionofpilocarpine(3,4).Mossyfibersproutingwasoccasionallyobservedintheinnermolecularlayeron7thdayafterinjectionofpilocarpine(5,6).Mossyfibersproutingwasconspicuouslyobservedintheinnermolecularlayeron15thdayafterinjectionofpilocarpine(7,8),withalotofAMGpositivegranulesalmostdistributingcontinuously.Mossyfibersproutingwasconspicuouslyobservedinthemolecularlayeron30thdayafterinjectionofpilocarpine(9,10),withlotsofAMGpositivegranulesdistributingcontinuously.Mossyfibersproutingwasconspicuouslyobservedintheinnermolecularlayeron60thd