应用rna干扰技术抑制结肠癌血管内皮生长因子表达

应用rna干扰技术抑制结肠癌血管内皮生长因子表达

血管再生对于肿瘤的生长非常重要。许多生长因子参与了血管再生，尤其是血管再生a。VEGF是一个45kDa的肝素结合生长因子,可以被低氧诱导因子1a所诱导而合成增加,它通过与其酪氨酸激酶受体,特别是VEGFR-2结合,参与血管再生的许多关键步骤,包括内皮细胞增生、侵蚀、迁移和存活,以及血管的通透性。VEGF可以被大多数肿瘤分泌,包括肺、胃肠道、肾、胸腺、膀胱、卵巢和宫颈,VEGF在体内的表达水平与肿瘤的进展和侵蚀相关。RNA干扰技术仍然是目前研究的热点,由于它们具有较强的序列特异性,并能有效的抑制靶基因的表达,故已被广泛应用于各种疾病的治疗和功能基因组学的研究中。已有研究应用siRNA抑制VEGF的表达,来治疗结肠癌、前列腺癌和肝癌,并取得了明显的效果。由于并不是所有与靶基因互补的序列都能产生强的RNA干扰作用,故在其走向临床应用前,必需有大量的实验来筛选,以获得更有效的序列,因此,我们设计了本实验,拟通过RNA干扰抑制结肠癌HT29细胞VEGF基因的表达,为下一步探讨VEGF基因在肿瘤发生和发展中的作用,以及抗肿瘤RNA干扰药物开发的研究奠定基础。1材料和方法1.1免疫荧光检测试剂质粒pTZU6+1,内含人U6启动子Ⅲ,由美国UniversityofMichiganDr.DavidEngelke馈赠;结肠癌细胞HT29均由本实验室提供;细胞培养用血清为国产四季青新生牛血清,1640培养基为本室提供;寡核苷酸DNA片段及引物合成由上海英俊公司完成,测序由上海英俊公司完成。T4DNA连接酶、内切酶和Marker为TaKaRa公司产品;质粒提取采用Qiagen公司的去内毒素大量提取试剂盒,转染试剂为美国Invitrogen公司的脂质体LipofectaminTM2000,其稀释液为Opti-MEM。RT-PCR检测用Qiagen公司的一步法试剂盒,细胞总RNA提取用Qiagen公司的RNeasyMinikit试剂盒。免疫荧光检测试剂盒SABC-Cy3购于武汉博士德公司,第一抗体小鼠抗人VEGF多抗购于北京中山公司,Cy3荧光标记的兔抗小鼠二抗购于武汉博士德公司。Westernblotting所需一抗,小鼠抗人VEGF多抗和小鼠抗人Actin,二抗,辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠IgG,均购于北京中山公司,辣根过氧化物酶的底物为美国Pierece公司SuperSignal化学发光底物,硝酸纤维膜(NC膜)购于德国Roche公司。Northern杂交用α-32P-dATP购于北京福瑞生物技术工程公司,DNA探针标记采用美国Amersham公司随机引物标记试剂盒MegaprimeDNAlabelingsystems进行,尼龙膜为德国Roche公司的HybondTMN+尼龙膜。凝胶成像和图像分析采用英国剑桥Synoptics有限公司生物影像系统中的geneGenius和GeneTools软件(版本3.05)进行。采用日本OlympusCK-40倒置荧光显微镜和美国MediaCybemeticsImage-ProPlusv5.1进行荧光检测和图像分析。1.2方法1.2.1vegf基因缺失菌株的构建抗VEGF的RNA干扰靶区选择参照E-RNAi网上提供的服务完成(http://e-rnai.dkfz.de/),先将VEGF的mRNA序列提交,得到全部的有效序列,选出两个得分较高且不含连续三个以上A的序列作为最终的VEGF靶序列,它们分别是:V1:TGAAGTTCATGGATGTCTATC和V2:ACATCACCATGCAGATTATGC,分别位于VEGF基因的122～142和302～322位。将其设计成能在体内转录成反向互补且以TTCG为环的小发夹样RNA。先人工合成寡核苷酸DNA片段,在含200mmol/LNaCl的退火缓冲液中进行退火,连接到pTZU6+1载体上,构建成抗VEGF基因的pShRNA-V1和pShRNA-V2,经酶切鉴定后,再测序证实。以抗绿荧光蛋白(GFP)的shRNA表达载体(pShRNA-GFP)作为无关干扰对照,GFP的靶区为GCTGACCCTGAAGTTCATC。1.2.2psql-4细胞的转染用脂质体将pShRNA-V1和pShRNA-V2分别转染HT29细胞,以未转染细胞或以不表达shRNA的空载体pTZU6+1的转染作为未干扰阴性对照,以pShRNA-GFP的转染作为无关干扰对照,转染方式按LipofectaminTM2000说明书进行,即当细胞90%以上融合时进行转染,先用稀释液Opti-MEM将质粒和脂质体稀释,再将二者混合,室温孵育20min后,直接加于含血清但不含抗生素的细胞培养基中即可。转染剂量参照我们以前优化的结果进行,即对100ml培养瓶中的细胞进行转染时,pShRNA表达载体或空载体pTZU6用5μg,脂质体LipofectaminTM2000用8μl。转染后48～72h后,收集细胞进行下游检测。1.2.3psbs--rna酶法胰酶消化收集细胞,细胞沉淀用10mlPBS漂洗一次,以后的操作按试剂盒说明进行,产物用50μl无RNA酶的水溶解,-80℃中保存,避免反复冻融。1.2.4vegf基因片段的扩增采用Prime3软件进行引物设计,其引物如下:VEGF的引物为,上游:5′-ctacctccaccatgccaagt-3′,下游:5′-aaatgctttctccgctctga-3′,扩增产物长度为411bp,退火温度为55℃,用一步法RT-PCR将其扩增出,电泳观察产物的大小与预期相符后,将产物装入pGEM-T载体上,再测序证实扩增产物为所需的VEGF基因片段。半定量检测时,以hGAPDH扩增产物为内参,hGAPDH的上游引物为5′-GGCTCTCCAGAACATCAT-3′,下游引物为5′-CACCTGGTGCTCAGTGTA-3′,扩增产物为240bp(678bp～918bp)。在一个总体积为25μl的反应体系中,同时加入VEGF和GAPDH两对引物,总RNA模板加1μl,逆转录条件为50℃,30min,PCR的退火温度为55℃,循环数为24,取5μl产物进行电泳,成像后用GeneTools软件进行定量分析。1.2.5vegf片段的标记25μg细胞总RNA上样电泳于1.2%的甲醛变性凝胶中,再过夜转移至尼龙膜上,80℃干烤2h固定后,42℃杂交过夜,探针为α-32P-dATP标记的VEGF片段,标记方法按试剂盒操作说明进行。尼龙膜经漂洗后,-80℃曝光48～72h。以凝胶电泳中总RNA的量作为内参,来恒定细胞总数。1.2.6封闭正常羊肉干转染48h后,将24孔板细胞用PBS洗涤一次,加4%多聚甲醛固定,再用PBS漂洗;加3%H2O2封闭内源性过氧化物酶,用PBS漂洗后,再用正常山羊血清封闭,室温1h。加入北京中杉公司鼠小鼠抗人VEGF多抗(1∶500稀释)37℃孵育2h,经PBS漂洗后,加入Cy3-标记的兔抗小鼠二抗,37℃孵育1h,PBS漂洗后,二甲苯透明,中性树胶封片,荧光显微镜下(波长568～574nm)观察阳性细胞并照相,阳性细胞呈鲜红色,用Image-ProPlus软件计算荧光亮度和细胞总数,以总荧光亮度与细胞总数的比值来反映VEGF表达水平。1.2.7vegf-计划免疫法检测免疫组化收集转染后72h的HT29细胞,用10mlPBS洗两遍,细胞沉淀用60μl蛋白上样缓冲液重悬混匀,煮沸5min,离心12000r/min,10min,取上清20μl加样于10%SDS凝胶,90V恒压,电泳2h,通过电转方式,将凝胶中蛋白质转移至NC膜上,将NC膜用封闭液封闭1h,于抗VEGF多克隆抗体中40℃过夜孵育,用200mlPBS漂洗3次,室温下在兔抗小鼠二抗中孵育1h,200mlPBS漂洗3次,加入1ml化学发光底物,2min后,于发光检测仪中检测并成像。NC膜再用200mlPBS漂洗3次,于抗Actin抗体中孵育1h,200mlPBS漂洗3次,室温下在兔抗小鼠二抗中孵育1h,200mlPBS漂洗3次,加入1ml化学发光底物,5min后,再于发光检测仪中检测并成像。2结果2.1重组质粒和空载体的鉴定重组质粒由于插入序列使原SalI酶切位点消失,故不能被SalI切开;重组质粒和空载体经HindIII和EcoRI双酶切,分别产生2800bp+395bp及2800bp+352bp的片段,可以通过电泳看出二者之间的差别,以此进行重组鉴定,最后测序证实序列正确。2.2egf基因片段先通过电泳观察扩增产物电泳的位置与预期411bp相符,再将其装入T载体上,测序证实为所需的VEGF基因片段。利用RT-PCR检测VEGF基因表达受抑情况,如图1,2所示,在HT29细胞中,与转染pShRNA-GFP相比,pShRNA-V1和V2均可以明显抑制VEGF基因的表达,GeneTools软件定量分析显示,pShRNA-V1和V2的抑制率分别为42%和40%。2.3vegfmna的抑制率在HT29细胞中,如图3,4所示,以凝胶电泳中总RNA为内参,GFP为无关序列干扰组,V1和V2组VEGFmRNA的抑制率分别为87%和89%。2.4胞浆内延迟表达如图5,6所示,免疫荧光检测显示,在HT29细胞中,VEGF表达主要以胞浆内弥漫分布为主,色泽鲜红;与无关干扰序列pTZU6-GFP和阴性对照pTZU6+1相比,pTZU6-V1和V2能明显抑制VEGF蛋白的表达,其抑制率分别为67%和73%。2.5psqla-pv、vdvp对vegf蛋白表达的影响如图7,8所示,Westernblotting显示,在HT29细胞中,与阴性对照pTZU6+1和无关干扰序列pShRNA-GFP相比,pShRNA-V1和V2能明显抑制VEGF蛋白的表达,其抑制率分别为69%和82%。3rna干扰对vegf基因表达的影响血管再生是在预存血管床的基础上产生新生毛细胞血管的过程,这一过程需要多种细胞因子参与。这一过程的不可控制,是导致肿瘤发生的重要病理基础。虽然一些蛋白,如肝细胞生长因子、肿瘤坏死因子和成纤维生长因子已被证实是血管再生的刺激物,但最重要血管再生生长因子是VEGF,它在人类的许多肿瘤中是过量表达的。诱导VEGF表达的机制有许多,其中缺氧长期以来一直被认为是VEGF潜在的诱导剂。研究发现,无论术前有无转移,手术后血清VEGF水平明显降低,这从一个侧面说明肿瘤细胞产生的VEGF可能是大肠癌血清VEGF的主要来源。研究表明,VEGF具有促进血管内皮细胞增殖;增加血管通透性;促进血管支持物的生成;抑制肿瘤细胞的凋亡的功能。由于VEGF的功能强大,故已成为肿瘤基因治疗的靶点。另外,现已发现VEGF的高表达还与类风湿性关节炎和眼底血管病变相关,故已有研究通过抑制VEGF表达来治疗这些疾病,并取得了显著的效果。RNA干扰作为一种新型的生物技术已广泛应用于多领域和多学科的研究中,并取得了显著的效果。已有研究通过RNA干扰技术,抑制结肠癌、前列腺癌和视网膜上皮细胞的VEGF基因的表达,并发现VEGF的抑制可以使肿瘤细胞的增殖能力减弱,肿瘤内新生血管减少,故认为针对VEGF基因进行的RNA干扰,是一种有效的抗肿瘤方式。我们在本实验中,也发现针对结肠癌HT29细胞VEGF的两种RNA干扰序列能有效抑制VEGFmRNA和蛋白的