补肾中药对地塞米松灌胃大鼠下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴功能受抑的实验研究

补肾中药对地塞米松灌胃大鼠下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴功能受抑的实验研究

本实验采用外源性糖皮质激素地塞米松灌胃，建立了植物脑出血-体育皮质（hpa）轴功能受抑制模型。采用电子显微镜、光学显微镜和血浆皮质酮放射免疫成像等技术手段。从形式和功能两个方面，它将重点从肾上腺束状带细胞的超微结构变化出发，并对上述动物进行了研究。动物实验亦模拟临床,从激素对人体影响的不同阶段进行滋肾阴和温肾阳这两组药物作用的观察,以便为皮质激素应用过程中阴阳转化物质基础的研究,进一步提供实验性依据。动物的标本采集及观察指标实验分7天实验及30天实验。一、7天实验:采用Wistar系成年雄性大鼠48只,平均体重267g(235～297g);随机分入4个实验组:对照组(C)、激素组(D)、激素加滋肾阴中药组(DYi)、激素加温肾阳中药组(DYa)。药物制备:地塞米松混悬液:每毫升混悬液含地塞米松15μg。滋肾阴中药:采用生地、知母、生甘草,用量为3:1:1,加水2500ml,煮沸浓缩过滤至含生药1.0g/ml。温肾阳中药:采用附子、肉桂、肉苁蓉、补骨脂、仙灵脾,用量为6:3:10:10:10,加水2500ml,煮沸浓缩过滤至含生药0.78g/ml。各组动物以下列药物灌胃:C组以生理盐水(1.5ml/100g体重);D组以地塞米松混悬液(7.5μg/100g体重)和生理盐水;DYi组以地塞米松混悬液和滋肾阴中药(1.0ml/100g体重);DYa组以地塞米松混悬液和温肾阳中药(1.0ml/100g体重)。其中地塞米松剂量相当于50kg体重成人剂量的5倍,中药剂量相当于50kg体重成人剂量的10倍。实验条件:室温12～20℃,湿度77～93%。灌胃时间:每日下午5时,共灌胃7次。标本采集及观察指标1.血标本采集及3H-血浆皮质酮测定:最后一次灌胃后39小时,即第9日晨8时断头处死;动物由笼内取出至断头,间隔不超过15秒。留取躯体血,用于血浆皮质酮测定(3H-皮质酮放射免疫试剂盒由上海市内分泌研究所提供)。2.组织标本采集:所有动物均取双侧肾上腺。按系统抽样设计方法,确定采取电镜标本或光镜标本的动物。(1)电镜标本:动物处死后迅速取动物左侧肾上腺皮质中间部,制作电镜标本,透射电镜观察肾上腺皮质束状带。在此基础上,对细胞内线粒体和脂滴作定量分析,取下列观察指标:皮质束状带细胞每线粒体含嵴数,束状带一定面积(204μM2,下同)内细胞出现管状嵴线粒体数与线粒体总数之比,以及一定面积内细胞脂滴数与线粒体总数之比。(2)光镜标本:以Carnoy氏液固定,肾上腺切片以组织化学Feulgen反应染色后,1500倍光镜下测量各实验组肾上腺皮质束状带细胞胞核面积。二、30天实验:采用Wistar成年雄性大鼠122只,平均体重231g(164～272g)。动物随机分组、各组处理、药物制备、实验条件、标本采集及观察指标均与7天实验相同。实验时间为30天,中途休息2天,共灌胃28次,最后一次灌胃后39小时,即第30天晨8时断头处死。结果一、7小鼠肝肾皮质束状带细胞电镜分析1.肾上腺皮质束状带细胞电子显微镜观察:电镜下对照组束状带细胞为不规则多边形,细胞核位于细胞正中。细胞质内均匀地布满线粒体、光面内质网和适量脂滴;线粒体为规则的圆或卵圆形,基质内布满圆形囊泡状嵴。光面内质网为小的囊状或扁板状结构。脂滴外缘光滑,直径大的脂滴外围被一层短小扁囊状光面内质网包围。(图1)7天实验各组束状带细胞主要变化:与其对照组比较,D组束状带细胞线粒体内大量囊泡状嵴转变为管状嵴,脂滴数增多,细胞质内出现致密螺旋膜状体(densewhorledmembranousbody,是细胞磷脂膜局部退行性变的一种形式)。DYi组束状带细胞线粒体内见少量囊泡状嵴转变为管状嵴,脂滴数减少。DYa组线粒体内有中等量囊泡状嵴转变为管状嵴,脂滴数增多。(图2～4)2.7天实验各组电镜下肾上腺皮质束状带细胞线粒体和脂滴定量分析,结果如表1。从表1可看出,7天实验各组间束状带一定面积内细胞出现管状嵴之线粒体数,以D组与DYa组为多,C组与DYi组较少。将一定面积内细胞出现管状嵴之线粒体数与线粒体总数之比作比较,C组与D组差别有极显著意义(P<0.001),DYi组与D组比较,差别有极显著性(P<0.001),DYa组与D组比较,差别无显著意义(P>0.05)。7天实验各组束状带一定面积内细胞脂滴数与线粒体总数之比,C组与DYi组较小,D组与DYa组较大;将各组间数值进行比较,C组与D组间,差别有显著性(P<0.01);DYi组与D组间,差别有极显著性(P<0.001);而DYa组与D组的差别无显著意义(P>0.05)。7天实验各组间束状带细胞内每线粒体含嵴数,差异无显著意义(P>0.05)。3.7天实验各组血浆皮质酮水平,列于表2。由表2可见,DYi组、DYa组以及C组血浆皮质酮水平均高于D组,差别有显著性(分别为P<0.01,P<0.01和P<0.05)。4.7天实验各组光镜下肾上腺皮质束状带细胞胞核面积测量结果,如表2所示。由表2可看出,7天实验各组束状带细胞胞核面积以C组及DYi组为大,它们与D组比较,差别分别有显著性(P<0.05)和非常显著性(P<0.01)。D组与DYa组细胞核面积小,两组间差别无显著意义(P>0.05)。二、30束状带细胞胞核面积1.肾上腺皮质束状带细胞电子显微镜观察:对照组所见同7天实验。其余各组束状带细胞主要变化:与其对照组比较,D组线粒体嵴数量减少,多表现为管状嵴,脂滴多,细胞质内出现致密螺旋膜状体。DYi组线粒体含嵴数量少,多数为管状嵴,脂滴多,DYa组线粒体内也出现较多管状嵴,但含嵴数量尚较多,脂滴较多。(图5～8)2.30天实验各组电镜下肾上腺皮质束状带细胞线粒体和脂滴定量分析,结果如表3。由表3可见,30天实验各组束状带细胞内每线粒体含嵴数以C组为最大,与D组比较,差别有极显著意义(P<0.001);DYa组线粒体含嵴数次之,与D组比较,差别有极显著意义(P<0.001);DYi组与D组最小,两组间差别无显著意义(P>0.05)。30天实验各组束状带一定面积内细胞出现管状嵴之线粒体数与线粒体总数之比,C组及DYa组为小,D组及DYi组为大。各组间进行比较,C组及DYa组与D组间差别均有显著意义(分别为P<0.001及P<0.01):DYi组与D组间差别有显著意义(P<0.05);而DYi组与DYa组间差别也有显著性(P<0.05)。30天实验各组束状带一定面积内细胞脂滴数与线粒体总数之比,C组与D组比较,差别有极显著性(P<0.01);DYi组及DYa组分别与D组比较时,差别无显著性(P>0.05)。3.30天实验各组血浆皮质酮水平,列于表4,其中C组与DYa组血浆皮质酮水平均高于D组,与D组比较,差别均有显著意义(分别为P<0.05及P<0.01);D组与DYi组比较,差别无显著性(P>0.05)。4.30天实验各组光镜下肾上腺皮质束状带细胞胞核面积测量结果,如表4所示。由表4可见,各组束状带细胞核面积,以C组及DYa组为大,与D组比较,差别均有非常显著意义(分别为P<0.001和P<0.01)。DYi组与D组的细胞核面积小,两组间差别无显著意义(P>0.05)。讨论一、功能异常表现为了将与细胞功能变化相应的超微结构变化定量地表示出来,本实验对细胞的线粒体和脂滴作了定量测定,包括:线粒体含嵴数、一定面积内细胞含管状嵴线粒体数与线粒体总数之比,以及一定面积内细胞脂滴数与线粒体数之比等。Kahri、Fujita、Nussdorfer等的研究指出:线粒体嵴数目减少,或由囊泡状转变为管状,必然伴有嵴内膜表面积的减少。在细胞功能亢奋状态时,束状带细胞线粒体嵴为圆形囊泡状;功能低下状态时,则为管状。大鼠肾上腺皮质类固醇激素合成必需的酶,除部分位于束状带细胞微体碎片(microsomalfraction,来源于光面内质网)外,其余部分位于线粒体嵴上。为此,线粒体嵴数量减少或管状嵴的出现,必伴有相应的类固醇生物合成酶的减少。本实验电镜资料定量分析中,均以D组的线粒体退行性变化最大。束状带细胞每线粒体含嵴数,30天实验DYa组接近于C组。一定面积内细胞出现管状嵴线粒体数,7天实验DYi组接近于C组:30天实验DYa组接近于C组。线粒体的这些微细结构变化表明:各实验组细胞的不同功能状态,即7天实验的DYi组、30天实验的DYa组束状带细胞功能,未受外源性地塞米松负反馈抑制的影响。大多数学者认为,合成类固醇激素的原料胆固醇,尤其胆固醇酯存在于脂滴内。地塞米松使脂滴内含物自束状带细胞的释放延缓或轻度减少,从而使细胞质内脂滴数相对增加。给动物注射ACTH后,细胞质内脂滴数相对减少。由此,脂滴数量的增减也可从一个侧面反映束状带细胞的功能状态。Rhodin指出,束状带细胞质内线粒体数和脂滴数之间有一个反比关系,即在脂滴和线粒体总数不变的条件下,脂滴数愈多,线粒体数愈少,表明细胞功能相对低下;反之,则表示细胞功能较为活跃。为此,本实验选用一定面积内脂滴数与线粒体数之比这一指标。结果表明,7天实验的DYi组接近于C组。二、束状带细胞超微结构检测一定量的外源性肾上腺皮质类固醇激素使垂体前叶的ACTH释放迅速受到抑制;后者转而使肾上腺皮质类固醇激素的释放也减少。国内曾有人报道,外源性肾上腺皮质激素造成动物肾上腺皮质功能的“耗竭”。本实验采用地塞米松混悬液对动物灌胃,剂量为7.5μg/100g体重。在用药后7天和30天,D组动物的血浆皮质酮水平均明显地低于C组,表明动物的HPA轴功能已明显受抑。本实验应用Feulgen反应这一组织化学专一性的单色染色法,在光镜下测量各实验组束状带细胞核的大小,避免了视野内其它有色物体的干扰,结果以7天实验DYi组及30天实验DYa组细胞核面积接近于C组。进一步观察束状带细胞的超微结构,发现给予地塞米松的D组动物束状带细胞线粒体含嵴数减少,线粒体内大量囊泡状嵴转变为管状嵴,脂滴数增多,细胞内出现致密螺旋膜状体等等变化。而给予地塞米松同时还分别给予滋肾阴或温肾阳中药,可见7天实验DYi组或30天实验DYa组的这些由激素引起的“耗竭”性变化要小得多。经统计学处理,证明这些细胞超微结构改变确实能反映一定的功能意义。上述电镜与光镜的观察结果,一方面从形态学角度说明了D组动物肾上腺皮质功能处于低下状态,HPA轴受抑动物模型成立;另一方面,联系各实验组血浆皮质酮水平:7天实验DYi组及C组均显著高于D组;30天实验C组及DYa组均显著高于DYi组与D组,说明了各实验组不同功能状态和形态结构改变具有一致性。至于7天实验DYa组血浆皮质酮水平高于D组,而束状带超微结构观察结果却表明此时DYa组肾上腺皮质已处于受抑状态;对这一现象的解释,是否由于:不同的实验指标对事物变化的敏感程度各异,出现这些变化的时间亦可前后参差。7天动物实验DYa组血浆皮质酮水平这一指标尚高于D组时,束状带超微结构观察这一微观指标却已显示出受抑的变化,也可能是,在整个肾上腺皮质功能还处于一种代偿状态时,部分束状带细胞的超微结构已显示出一定受抑变化;此外,温补肾阳药是否可能干扰血浆皮质酮的测定,这些都有待于进一步研究。三、平台3不同阶段的特殊药代动力学上海第一医学院脏象专题组1960年以后的研究表明:肾阳虚患者有HPA轴功能低下和紊乱。应用温补肾阳药治疗后,则可使大部份患者的功能紊乱从症状或临床检验上得到改善或纠正。动物实验还观察到:长期大剂量喂饲激素可引起肾上腺皮质明显萎缩,而以滋阴泻火或温补肾阳中药与激素同时喂饲,则可在一定程度上对抗激素对肾上腺皮质的抑制作用,使皮质的萎缩程度明显减轻。本实验设计除对照组外,设D组、DYi组和DYa组,实验分短期(7天)和长期(30天)两大组,以了解补肾中药配合激素应用的不同阶段效应。综合7天实验和30天实验各组形态学和功能定量分析结果,可以看出,7天实验的DYi组及C组,其功能明显优于