dna甲基化与癌症

dna甲基化与癌症

1低甲基化型cpg位点甲基化是对基因表达的重要控制。甲基化的位点是在CpG双核苷酸序列中胞嘧啶的5号碳原子上。在人类基因组中大多CpG位点都是高度甲基化的,还有少数CpG位点是低度甲基化的。这种低甲基化的CpG位点分布在基因组的少数DNA区域(约占DNA的2%)中。这些区域大小约为1kb左右,约每10bp就会出现一个CpG位点。在整个基因组中大约含有45000多个这种1kb左右的DNA序列。它们散布在基因组中,称CpG岛。CpG岛一般位于基因的启动子区,有时还包括基因5′端的外显子和内含子,它们与基因的5′端密切相关。在人类基因组中,管家基因和4%的组织特异性基因中含有CpG岛。研究发现表达基因在它的启动子区的CpG岛处表现低度甲基化,而CpG岛高度甲基化将导致基因不表达。2cpg岛甲基化GhoshalK等最近的研究表明甲基化能抑制基因表达,金属硫蛋白I能被许多金属和氧化剂诱导,但淋巴源性癌细胞却不同,他们通过实验证实导致鼠实体移植肿瘤MT-I基因受抑是由于在启动子-225bp到+1bp中的21个CpG岛甲基化而造成的,基因组印迹实验显示肝癌MT-I启动子顺式作用元件无转录活性,而这不是由于(Metalregulatorytranscriptionfactor1)MTF-1失活引起,因为它在癌瘤中有高活性。用脱甲基化试剂5-杂氮胞嘧啶处理移植瘤鼠导致了MT-1基因的表达。酸式硫酸盐测序约90%的MT-1启动子的CpG岛甲基化。另外,DNA甲基转移酶活性大大增加,约为正常组织的七倍。这说明高度甲基化使MT-1基因表达受抑,而甲基化与DNA甲基转移酶活性增加有关。在成年鸡235bp的p-球蛋白启动子基因的CpG岛几乎全部甲基化,这时该基因不能转录。而出生5天后的小鸡这个基因能正常转录,这时发现在CpG岛上的甲基化作用去除,更进一步研究发现成年鸡p-球蛋白基因5′启动子上游有一个叫氯霉素乙酰基转移酶基因(pCAT)的增强子,而CpG岛甲基化抑制转录的作用明显大于增强子的作用,所以转录受到抑制。SIingalR等提取鸡类红细胞核酸,经过研究发现p-球蛋白启动子上结合有甲基胞嘧啶蛋白复合物(MeCPC),这种复合物的结合与CpG岛的甲基化作用共同导致p-球蛋白的转录受到抑制。在肝细胞癌(HCC)中P16基因的失活是比较常见的。实验证实P16基因的失活机制包括:纯合子丢失、启动子甲基化及点突变,其中最易发生的改变是5′CpG岛的甲基化。最近在研究胰岛素样生长因子(insulin-likegrowthfactor2,IGF2)和H19基因时,发现甲基化可影响“脊椎动物增强子阻碍蛋白”(vertebrateenhancer-blockingprotein,CTCF)的活性来调节转录,通过调节增强子靠近启动子的边界区来调节基因表达。3甲基化、突变、丢失与肺癌甲基化与癌症的关系:经大量的研究发现一些癌基因如:Rb、VHL、P16INK4α、P15INK4b、hMLH1、APC、BRCA1等启动子高度甲基化后,可使这些基因表达受抑,研究hMLH基因时发现,“错误配对修复系统”(mismatchrepairsystem,MMRS)中的“错配矫正酶”的编码基因(mutH、mutL、mutS)由于甲基化使表达受到抑制,当用5-杂氮脱氧胞嘧啶处理后,此基因又恢复表达,重新发挥修复功能,科学家发现抑癌基因由于甲基化而受抑,接着发生突变或者丢失。目前发现抑癌基因甲基化、突变、丢失与癌症关系密切。现已发现“CpG”岛甲基化是突变热点原因在于:(1)不同的修复效率:由于碱基的自发脱氨基,胞嘧啶脱氨基转变为尿嘧啶,机体有高效丰富的尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG),可使尿嘧啶变为胞嘧啶,脱氨基的5-甲基胞嘧啶变化为胸腺嘧啶,然而,胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)在机体则含量低、活性弱,这样由于甲基化的“CpG”岛增加了C向T的转变。(2)细胞分裂生长速度:细胞未分裂时,5-甲基胞嘧啶和胞嘧啶一样,不引起突变,当癌细胞或损伤组织进行修复时细胞分裂生长速度加快,5-甲基胞嘧啶容易导致突变。抑癌基因在编码区CpG岛甲基化后易造成突变,从而引发癌症。最近研究非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin′slymphomas,NHLs)病人抑癌基因甲基化时发现p16ink4a和p15ink4b甲基化可能作为一个好的标记物有助于证实病人有无复发的可能性。4甲基化的机制DNA甲基化与染色质变化有密切关系,染色质通过组蛋白八聚体“尾”乙酰化与脱乙酰基来增强转录和抑制转录,现已发现转录受抑的基因除了大量的甲基化外,还有很多低乙酰化的组蛋白,甲基结合蛋白MeCP2与甲基化的DNA抑制转录有关,还有组蛋白脱乙酰基酶HDAC1通过桥蛋白Sin3起作用。结果使染色质结构紧缩,抑制转录。而对于甲基化的机制,人们普遍支持“从头合成途径”,特别是人与鼠DNA甲基转移酶的克隆与表达,对于甲基化的机制有了更深入的认识,此酶C-末端有催化结构域,同细菌的“5-胞嘧啶甲基化酶”同源,N-末端有调节结构域(DNMT)。DNMT的作用是使CpG岛甲基化。DNMT的过度表达加速了甲基化的从头合成。目前发现DNMT家族包括DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b等类型,科学家已从广泛甲基化的癌瘤组织检测出DNMT1及DNMT3的高活性。甲基转移酶既参加甲基化从头合成,也可以参加甲基化补救合成,与这种酶作用相反的是DNA脱甲基酶,它可以使DNA序列脱去甲基,在肿瘤组织中存在CpG岛广泛的高度甲基化与低度甲基化,推测与这两种酶作用失调有关。5甲基化的检测由于CpG岛多数都位于基因的5′端,所以用CpG岛序列作为标记位点,常常能够获得具有完整5′端的基因。因CpG岛中多数都包含有很稀有的酶切位点,现在常用方法是用SacⅡ、BsshⅡ、EagⅠ酶解DNA后,经脉冲凝胶电泳分析酶切结果,找到CpG岛。分析研究甲基化较好的技术是“酸式硫酸盐测序法”,这种方法是先将待分析的DNA放入碱中变性,然后用酸式硫酸钠及氢醌在pH5.0温度50℃处理16~40h以便使胞嘧啶脱去氨基变为尿嘧啶,而5-甲基胞嘧啶则不能脱氨基。接着除去多余的酸式硫酸盐,真空抽干。接下来对处理过的DNA片段做PCR扩增,克隆到质粒载体中测序。因为经酸式硫酸盐处理后,胞嘧啶脱氨基变为尿嘧啶,而甲基胞嘧啶则不能转变,因尿嘧啶及胸腺嘧啶经PCR可扩增为胸腺嘧啶,而5-甲基胞嘧啶则扩增为胞嘧啶。测序后可得到甲基化图,了解甲基化的情况。另外有学者对甲基化调控蛋白MeCP2进行改造,使其只保留与甲基化CpG岛结合的性质,改造后的蛋白称MBD。将MBD与层析柱偶联后,制成可以吸附具有一定甲基化程度的CpG文库,从这个文库中可筛选外显子序列及DNA甲基化对基因表达的调控研究。此外,还有“限制性界标基因组扫描”(Restrictionlandmarkgenomescanning)、“典型性差异分析”(Representationaldifferenceanalysis,RDA)、“甲基化敏感随机引物PCR”(Methylated-sensetivearbitrarilyprimedPCR,AP-PCR)、“甲基化CpG岛扩增技术”(MethylatedCpGislandsamplification,MCA)等方法技术。6甲基化抑制剂今后,对DNA甲基化的研究一是集中在甲基化系统功能失调后如何引起癌症及肿瘤特异性细胞的变化,DNMT1及最近发现的DNMT3家族在肿瘤组织中高度表达,今后将发现一系列的DNMT3及弄清楚它们所催化的不同的底物,从而证实甲基化的CpG岛与某种癌的关系,目前已知DNMT有不同的亚细胞定位及在细胞核中分布于不同的部位,而且在不同的细胞周期调节不同。另外一个研究任务是研究DNA甲基化与DNA修复和基因组稳定的关系,最近发现的新的MMR蛋白MED1(也称为MBD4)证实与hMLH1有关,此酶N-末端有优先结合于甲基化DNA的结构域,C-末端有内切酶的活性,进一步的研究将证实这种新蛋白是否能够修复脱氨基的5-甲基胞嘧啶及是否与细菌修复新合成DNA链的MutH基因同源。还有一个临床上研究热点是对于抑癌基因甲基化受抑制导致肿瘤的研究,科学家通过各种方法恢复由于甲基化而受抑的抑癌基因,目前已发现DNA甲基化抑制剂可恢复受抑的抑癌基因如:抑癌基因CDKN2A被甲基化抑制剂处理后可减少癌细胞的增长速度。给小鼠使用DNA甲基化抑制剂可抑制肿瘤的发生,这给临床上预防肿瘤带来了启示。临床上已将这种制剂用于骨髓发育不良综合症,已产生良好的效果,但这些制剂也有不足之处,可引起基因突变。目前科学家发现了一种比较好的方法,使用反义寡聚核苷酸,它能抑制甲基转移酶并减少肿瘤的增长,这在临床实验中已得到验证。DNA甲基化还可以用于临床疾病的诊断,DN