第08章 核酸药物与基因治疗_第1页
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第08章核酸药物与基因治疗本章的重点内容：1.什么是基因工程？2.获得目的基因的方法有哪些？3.DNA双脱氧测序技术的基本原理。

4.PCR技术的基本原理及其应用。5.基因定点突变技术及其应用。6.表达载体的构建策略与技术方法。第一节基因工程原理简介一、基因工程的定义本义：根据人们的意愿，利用工程设计的方法，在体外将克隆获得的目的基因与适当的载体进行切割和连接，构建成正确的重组表达载体，再应用物理的、化学的或生物学的方法将该表达载体导入到细菌、动植物细胞或受精卵中，使目的基因在宿主体内以瞬时方式或稳定方式进行表达，借此研究目的基因的结构与功能，或赋予宿主以新的遗传性状，或获得该基因的表达产物。这一过程就是基因工程。

广义：转基因动物；克隆；基因打靶；基因组计划等均属于基因工程的范畴。目的基因获得表达载体构建与鉴定基因的导入整合与表达的鉴定二、基因工程的基本步骤表达产物的提取、纯化与鉴定核酸药物基因工程药物第二节基因工程中的方法学一、基因工程的基本技术（一）核酸的提取纯化

1.RNA提取纯化技术；

2.DNA提取纯化技术；

3.plasmid提取纯化技术。（二）核酸电泳技术

1.琼脂糖凝胶电泳

2.SDS（三）感受态细胞的制备与转化真核细胞总RNA的电泳结果：核酸电泳技术

1.琼脂糖凝胶电泳2.SDS500200010007501002001DL2000marker2BamHI和EcoRI双切3BamHI单切4HindⅢ单切5重组质粒pVAX1/ABPS112345二、一些重要技术原理介绍

重点：DNA双脱氧测序技术，核酸探针技术，PCR技术等。（参见第5章）（一）DNA双脱氧测序（二）核酸杂交技术（三）PCR技术

（四）目的基因的改造技术1.引物介导的基因定点突变技术2.盒式突变(cassettemutagenesis)

3.GenesShuffling三、基因工程中的工具（一）载体

1.质粒(plasmid)2.粘粒(cosmid)3.λ噬菌体(λphage)（二）工具酶1.限制性内切酶2.外切酶3.连接酶4.聚合酶:klenowI5.核酸酶（三）宿主菌DH5,JM101,JM109;DE3等四、获得目的基因的方法

基因文库（基因组文库和cDNA文库），化学合成，PCR等方法。还有DD-PCR以及基因芯片等技术。（一）基因组文库目的：种质资源的保护；基因组测序；基因组基因或调控序列的克隆等。（二）cDNA文库的构建五、表达载体（重组质粒）的构建与鉴定1.DNA（载体和目的片段）的酶切与回收。2.目的片段与载体的连接。二者的摩尔比应满足以下比例：粘端：3~5:1；钝端：6~8:13.转化与重组质粒的筛选、鉴定。1）初步鉴定：抗性；α-互补；快速鉴定；原位杂交；PCR。2）酶切鉴定：大小和方向。3）测序鉴定：双脱氧测序法。六、基因导入技术（一）细菌

1.氯化钙；2.电穿孔技术。（二）细胞1.脂质体；2.磷酸钙；3.电穿孔；4.显微注射；5.VirusVector。（三）受精卵1.显微注射；

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