第三章 基因工程目的基因的获取分离

第三章基因工程目的基因的获取分离

直接从染色体DNA中分离人工化学合成通过mRNA逆转录合成cDNA

从基因文库中分离

PCR扩增特定的基因片段一化学合成法1基因片段的全化学合成2基因片段的化学-酶促合成二基因的酶促合成（逆转录法）mRNAcDNA逆转录酶图1基因的化学合成及克隆图2基因的化学-酶促合成三基因组文库分离目的基因基因组文库：指某一生物的全部基因的集合。

基因组文库：指用全基因组DNA，通过几种限制性内切酶切割，所产生的基因组DNA片段与载体重组并克隆，由此产生的克隆群体包含了基因组DNA的所有序列，称基因组文库。

基因组文库的大小的估算：N=ln（1–P）/ln（1–f）N：为基因组文库必需的克隆数目。P：为文库中含目的基因DNA片段的出现概率。f：是插入片段的大小与全基因组大小的比值。（一）基因组文库的建立基因组文库应具有的克隆子数基因组大小/bp2×106（细菌）2×107

（真菌）2×109（动物）理论克隆数实际克隆数理论克隆数实际克隆数理论克隆数实际克隆数克隆片段平均大小（bp）5×103400

1831

4000

18418

600000

276311010×103200

919

2000

9208

300000

138155020×103100

458

1000

4603

150000

69077440×103

50

278

500

2300

75000

345386

总RNAmRNAtRNArRNAcDNA文库：指用一种生物的mRNA经逆转录合成的互补

DNA所建立的文库。

（1）随机引物引导法（2）oligo（dT）引导法

1

mRNA分离

2合成cDNA第一条链（二）cDNA文库的建立cDNA文库的构建共分四步

第一：细胞总RNA的提取和mRNA分离；

第二：第一链cDNA合成；

第三：第二链cDNA合成；

第四：双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖。（1）随机引物引导法（2）oligo（dT）引导法

3´5´5´mRNAmRNA3´5´逆转录酶、连接酶3´cDNA第一条链dNTP3´5´mRNAAAAAAATTTTTT3´5´AAAAAATTTTTTKlenow酶mRNAcDNA第一条链dNTP3第二条链的合成（1）自身引导法用氢氧化钠消化杂合双链中的mRNA链解离的第一链cDNA的3‘-末端就会形成一个发夹环（发夹环的产生是第一链cDNA合成时的特性，原因至今未知，据推测可能是由帽子的特殊结构相关）引导DNA聚合酶复制出第二链，此时形成的双链之间是连接在一起的再利用S1核酸酶将连接处（仅该位点处为单链结构）切断形成平端结构可以进行连接。

cDNA第二链合成的方法有四种，自身引导合成法，置换合成法，引导合成法和引物－衔接头合成法。缺点:在以S1核酸酶切割cDNA的发夹状结构时,会导致对应于mRNA5'端的地方的序列出现缺失和重排.S1核酸酶的纯度不够时,会偶尔破坏合成的双链cDNA分子（2）双链cDNA的置换合成它是由一组酶共同控制，包括RNA酶H、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ和DNA连接酶。mRNA－cDNA杂合双链中的mRNA链在RNA酶H作用下先形成很多切口，mRNA链就被切割成很多的小片段，这些小片段为大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ提供了合成第二链的引物。大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ以第一链cDNA为模板合成一段段互补的cDNA片段。这些cDNA片段进而在DNA连接酶的作用下连接成一条链，即cDNA的第二链遗留在5'-末端的一段很小的mRNA也被大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的5'--3'核酸外切酶和RNA酶H降解，暴露出与第一链cDNA对应的3'-端部分序列。同时，大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的3'--5'核酸外切酶的活性可将暴露出的第一链cDNA的3'-端部分消化掉，形成平端或差不多