鱼中结晶紫的检测方案

鱼中结晶紫的检测方案工分专122张启阳、尹彬竹、向乾元、魏俊前言

结晶紫属于三苯甲烷类染料，化学性质，暗绿色闪光粉末或粒子。溶于冷水和热水，呈紫色，极易溶于乙醇。于浓硫酸中呈红黄色，稀释后呈暗绿光黄色，然后转变成蓝和紫色，结晶紫这种化合物对鱼类的水霉病、寄生虫病等有很好的疗效，长期以来许多国家曾将其作为水产养殖业的杀菌剂。它们在鱼体内可分别代谢为和无色结晶紫，由于其母体化合物和代谢物均具有潜在的致癌、致畸、致突变等副作用，20世纪90年代以来许多国家都将其列为水产养殖的禁用药物。但是由于其抗菌效果好、价格便宜，不少业户仍在违规使用，因此结晶紫残留监控就显得格外重要。

实验材料与方法试验结果结果讨论结晶紫的检测方案123样品的提取的保存试剂和溶液

鲈鱼，从超市里购买鲈鱼活样品，取其肌肉，各自用均质机混均，每个样品各400g，于-20℃冰箱保存备用。

样品与方法

结晶紫标准品：纯度93.9%；结晶紫快速检测前处理试剂盒，由中国检验检疫科学研究院北京陆桥商检新技术公司生产。酸性氧化铝固相萃取柱（500mg，3mL），PRS固相萃取柱（500mg，3mL），乙腈为色谱纯，无水乙酸铵、冰乙酸、对-甲苯磺酸、乙酸钠、硼氢化钾均为分析纯，实验用水为去离子水。孔雀石绿乙腈溶液;结晶紫标准储备液：100µg/mL结晶紫乙腈溶液;、结晶紫混合标准中间溶液：10µg/mL;乙酸钠缓冲液：0.06mol/L乙酸钠+0.005mol/L对甲苯磺酸，pH4.5;乙酸铵缓冲溶液：0.125mol/L，pH4.5;硼氢化钾溶液：0.07mol/L，现配现用;洗脱液：乙酸乙酯∶甲醇∶氨水体积比10∶9∶1样品预处理提取：准确称取5.00g已搅碎的样品于50mL离心管中，加入结晶紫快速检测前处理试剂盒中提取剂1（20mL，由有机化学试剂组成的混合液体试剂）和提取剂2（由无机化学组成的混合粉末试剂），8000r/min的速度均质30s，振荡2min，4500r/min离心5min，取上清液10.0mL于鸡心瓶中，45℃水浴旋转蒸发至近干，用2.5mL乙腈溶解残渣。净化:将PRS柱安装在固相萃取装置上，上端串联酸性氧化铝柱，用5mL乙腈活化，转移提取液到柱上，再用2.5mL乙腈洗涤瓶一次，过柱，重复操作一次，去掉酸性氧化铝柱，用5mL乙腈清洗PRS柱，氮吹PRS柱至近干，在不抽真空清况下，加入5mL洗脱液洗脱，收集全部洗脱液，氮气吹至近干，加0.4mL硼氢化钾溶液，还原，静置20min，用乙腈定溶至1.0mL，经聚四氟乙烯膜过滤后上机分析

实验方法的选择

目前结晶紫检测方法主要有高效液相色谱法[1-3]和液质联用法[4-5]。我国于2006年发布有关的水产行业标准（SN/T1768-2006）[6]及国家标准（GB/T20361-2006）[7]。行业标准SN/T1768-2006前处理简单，但是满足不了检测限0.5µg/kg的要求。其他方法的前处理均需多次萃取，多次离心，操作烦琐，前处理时间长，有机溶剂用量大，实际检测工作中存在困难。本文综合各个方法标准中快速和灵敏的优点，建立了同时检测，结晶紫以及代谢物无色结晶紫总量的高效液相色谱法。仪器：Agilent1200型高效液相色谱仪、均质机、离心机、振荡器、旋转蒸发器、固相萃取装置、氮吹仪。色谱条件：色谱柱，Eclipse-C18250mm×4.6mm，粒度5µm；流动相，乙腈+乙酸铵缓冲液（pH4.5）=80+20；流速1.5mL/min；柱温35℃；激发波长265nm,发射波长360nm；进样量20µL仪器与色谱条件

在临用前准确吸取一定量的混合标准中间溶液，加入0.4mL硼氢化钾溶液，用乙腈准确稀释至2.0mL，配制适当浓度的混合标准工作液。在上述色谱条件下，分别测定结晶紫混合标准工作溶液及样品提取溶液中的结晶紫，外标法定量。

样品测定

准确度和精密度实验

以本底无结晶紫、隐性结晶紫的鲈鱼为样品，平行称取3份样品，按5µg/kg、10µg/kg、20µg/kg三个加标浓度进行加标，按上述步骤进行前处理和色谱测定，分别测定各次的峰面积，计算样品中结晶紫的含量，计算回收率。另取6个平行样品，采用添加法分别添加等量结晶紫混合标准溶液，按上述步骤进行前处理和色谱测定，分别测定各次的峰面积,计算样品中结晶紫的含量，计算相对标准偏差。计算

以标准工作液峰面积和浓度作工作曲线，根据样品提取液的峰面积，从工作曲线计算样品提取液中结晶紫的残留量，按式⑴计算样品中结晶紫残留量。计算结果需扣除空白值。

X=(CxVx2)/m

式中：X—试样中的结晶紫的残留量，µg/kg；

C—样品提取液中结晶紫的残留量，ng/mL；

V—最终定容体积，mL；