细胞培养细节归纳

细胞培养细节归纳常见问题及其原因分析培养过程的细节复苏

分皿接毒冻存细胞板的使用需进一步解决的问题常见问题及其原因分析一污染1细菌污染特点：24h后或分皿细胞全部漂浮、培养液浑浊、镜下可见细菌穿梭运动、LB上可长出菌落、打开瓶盖时有味原因：细菌污染一般比较少见，问题一般出在培养基上。操作上（比如配培养基瓶子未干烤、配培养基过滤时滤膜松动。）如果培养液被污染，则未开瓶的培养基在4度放2周后，会出现发黄，细菌沉淀下来，摇动后，浑浊。配培养液时需小心2支原体污染特点：污染初期细胞生长不受影响，后细胞生长变慢。最后细胞完全长不起来。培养液很容易变黄，分瓶10h时就出现培养基发黄。原因：细胞瓶养细胞时少见。板子养细胞时常见。一般在做铺板子时觉察不到，但是在做单抗过程中由于要在板子中传代，所以很容易发生。常与操作有关（枪头不是每次新高压、操作时手从板子上过等）。操作时需小心3病毒之间的交叉污染（时刻警惕！！）养成良好的实验习惯和规范操作。比如：洗手、操净台预开15min、开紫外灯等定期用一瓶细胞提DNA检测。

进细胞培养的房间需穿房间内的白大褂！二细胞长过头（常见）细胞分瓶时间的把握：由于在细胞瓶中，中间细胞长得比较快，所以要以瓶中间细胞的量为标准，90%时分，不要在意瓶子头和尾部的细胞量。SP2/0细胞尤其要注意：不能以90%为标准，细胞一个连着一个时即需要分，不能等到细胞一个挤一个时分。（视野下细胞一个连着一个时为圆形，一个挤一个时细胞成多边形）。细胞一旦长过头，即弃掉，已失去价值，不必浪费时间。3消化过头和消化不够（很常见）消化过头，传代的细胞内会出现团块，且这种团块随着传代而传代。消化不够，细胞吹不下来，若强行吹，第二天发现细胞漂浮的多了。所以消化时间的把握很重要，需要固定一个适当的消化时间。Huh-7为3分钟，PK-15为30秒。

PK-15细胞：一次消化细胞瓶少时不会出现消化过的情况，一次操作瓶子过多就会出现。

建议：每次消化的细胞瓶不超过6瓶，瓶子量大时，可分多批次进行分瓶操作。（量力而行！）CAL27细胞常消化不够。消化时间掌握非常重要。要固定。如果今天5min，明天6min，则后天5min就失效了！如果消化不够，原瓶就弃了，不必二次消化。一般讲，每次固定消化时间后，不会出现消化不够的情况。4细胞形态变差常常于生长环境有关，因此需要保证细胞瓶的洁净度和培养基批次间的均一性！

培养基批次间的均一性

注意：培养液的PH会随着瓶盖打开的次数和培养液暴露在空气间的时间增长而降低，培养液出现紫红色。

建议：所养细胞瓶数少时，将培养液用50ml瓶子分装！SP2/0状态好时镜下很少见到漂浮的细胞，但是换培养基后有可能变差。虽然10%DMEM和HT都能养SP2/0细胞，但是一旦两种培养基突然互换，细胞大小会出现明显差异！！细胞分瓶时一对二或三分，不能混合起来最后一起分。长得不好的细胞不参与分瓶，需弃掉。培养过程的细节一复苏1从液氮罐取2支细胞（2支复苏一瓶效果更好），迅速置于37度水浴中，待完全融化之前，迅速插于冰浴中2离心管中加8ml10%DMEM培养液，将细胞缓慢滴加于培养液中，滴加时要一滴一滴地加，由慢到快，需边滴边摇。31000rpm离心10min，倾去培养液（需完全），重加1ml培养液，轻轻吹匀4细胞瓶中预先加3管培养液，将吹匀的细胞缓慢滴加于培养液中，滴加时要一滴一滴，由慢到快，摇匀54-6小时后，倾去原培养液（未贴壁的死细胞较多），PBS洗2次，换新的培养液6注意多观察细胞，细胞长到50%时，需重换一次新培养液。

我们在操作中遇到杂交瘤比较难复苏。一支杂交瘤直接复苏至细胞瓶时，一般长不出来；两支杂交瘤一起复苏至细胞瓶时，长势也不好，即使补充饲养细胞效果也不好。因此，我操作时采用在6孔板中复苏（加饲养细胞）的办法！！估计这与杂交瘤冻存前的状态及冻存方法有关！原因可能是：杂交瘤代次低二分瓶1观察细胞瓶中央，视野下细胞长到90%前必须分瓶（在这个情况下，瓶子头部和尾部大约长到了60-70%，不必等到他们长到90%）2PBS洗2次，加胰酶1管，平拿细胞瓶，轻轻摇晃30-40下（保证每晃一下胰酶均与壁上细胞接触），3放培养箱2.5-3min（Dulac细胞）每次时间长短最好固定）后，PBS洗轻轻荡洗2次4轻轻吹下细胞，分装于新瓶中，避免产生泡沫SP2/0细胞分瓶必须非常及时，一个连一个时就要分瓶了，此时培养液为黄红相间色，不要等到培养液明显变黄色。吹细胞要轻，每次换新瓶，7-10天时细胞状态会最好，最好时视野下只见极个别的漂浮细胞。选最好的细胞用来融合。三接毒(针对PCV1-2或PCV2)1细胞中央长到30%（大约在分瓶后10-12小时）前，开始接毒2倾去培养液，洗2次后，加1管无抗无血DMEM