菌种管理操作规程

菌种管理操作规程1.目的规范本中心标准菌种和野生菌种的管理。2.范围本规程适用于标准菌种和实验过程中分离纯化的野生菌种的管理。3.职责3.1菌种管理员：负责菌种的申购、接收、保存、分发。3.2微生物检验员：负责菌种的确认、传代、使用及销毁。3.3科室负责人：负责指导、监督检验员和管理员对菌种的管理。4.术语4.1标准菌种(冻干菌种)：由国内或国际菌种保藏机构保藏的，遗传学特性得到确认和保证并可追溯的菌种。4.2标准储备菌种：又称传代用菌种，由标准菌种经一次传代得到的培养物，是指用标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作菌种。4.3工作菌种：工作菌种是指用标准菌种或标准储备菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。4.4代：菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻菌种为第0代（G0）。5.程序5.1菌种的申购菌种管理员每年根据菌种的使用情况（包括临时检验需要）提出购买计划，经批准后，向菌种保藏中心购买标准菌种（冻干菌种），采购执行《服务和供应品的采购程序》。5.2菌种的接收菌种到达实验室后，由菌种管理员接收菌种，检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写《标准菌种接收记录表》，贴好标签并按照该菌适宜储存条件进行储存（储存期及储存条件见菌种说明书）。5.3菌种的编号5.3.1标准/标准储备菌种采用字母加数字表示：英文缩写字母-来源编号-代次-传代日期-顺序号。菌种的英文缩写字母：大肠埃希菌（E.c）、金黄色葡萄球菌（S.a）、枯草芽孢杆菌（B.s）、黑曲霉菌（A.n）、白假丝酵母（C.a）等，来源以购进方编号为准；代数用一位带有下标数字的字母表示；标准/标准储备菌种用G表示；工作菌种用W表示；如G3表示标准菌种第3代；W3表示工作用菌种第3代。传代日期用6位数字表示：年份取最后两位数，月、日分别用两位数。如2012年1月12日传代的第一支来源于CICC编号为23657的大肠埃希菌作为传代用菌种的编号为：E.c-CICC23657-G3-120112-01。另外标准菌种编号为E.c-CICC23657-G0（无传代日期和顺序号）。5.3.2野生菌种采用字母加数字表示：英文缩写字母-来源缩写（野生-Y.s）-代次-传代日期-顺序号。菌种的英文缩写字母：如经过菌种确认英文缩写字母可按照上述1进行缩写，如未经菌种确认英文缩写字母则用W.z（未知）代替；其余同上述1，如2012年1月12日第二次传代的第1支未知野生菌种的编号为：W.z-Y.s-G2-120112-01。5.4菌种的保藏5.4.1标准/标准储备菌种的保藏采用斜面定期移植法、液体石蜡法、甘油冷冻保藏法、瓷珠保藏法四种方法对我中心各类型标准菌种进行保藏，其详细操作见《菌种保藏操作规程》。5.4.2工作用菌种的保存工作用菌种同《菌种保藏操作规程》中所述斜面定期移植法。5.4.3菌种的保存方法、条件及期限见《标准储备菌种保存方法表》。5.5菌种的复苏5.5.1标准菌种的复苏复苏菌种前应准备适于该菌种生长的固体或液体培养基或标配菌种复溶液（稀释液）以及相应的培养设备，所有操作均应在符合生物安全保护及无菌条件下进行。SDB用于黑曲霉、白色念珠菌复苏、复壮，液体硫乙醇酸盐培养基用于生孢梭菌复苏、复壮，营养肉汤或BHI培养基用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。5.5.2疫苗瓶开封：拉开易撕铝盖，用浸过75%酒精的脱脂棉擦净丁基胶塞及疫苗瓶。5.5.3加复溶培养基500μL于标准菌种内，待溶解混匀后，用接种环挑取菌液直接在划到平皿上，在35-37℃需氧/厌氧条件下培养。（注：干粉型标准菌株加入稀释液后，宜在30分钟内使用完，不建议再重复使用）5.5.4若未能活化，或活化后有疑问时，请于收到菌种1个月内，通知保藏中心。5.5.5注意事项菌种活化前，请保存在-20℃的环境下。嗜血杆菌、奈瑟氏菌属等初代培养需要5-10%CO2环境，用血平板培养。厌氧菌的培养，如特别说明，自开封至接种完成，均需以无氧气体充填，以保持厌氧状态。某些菌经过冷冻干燥保存后，延迟期较长，需连续两次继代培养才能正常生长后使用。5.6标准菌种的确认5.6.1用无菌接种环取上述培养物接种到相应的培养基平板上，或相应的宜于该菌生长的鉴别培养基平板上，然后在30-36℃下培养3天（细菌）；23～28℃下培养5天（真菌和酵母菌）。5.6.2培养后，首先观察其是否具有典型的菌落形态，然后挑取生长旺盛的单一的纯菌落，划线于平皿培养基，每种菌划4个平皿，以便收集较多的生长旺盛的典型单菌落，进行保存和确认。5.6.3菌种的确认结果，记录在《标准菌种确认记录表》上。5.7标准菌种传代5.7.1按菌种说明书要求复溶菌粉，转接至平板上，并在适当温度下培养适当时间，分离单个纯种菌落，此为第1代（G1）。5.7.2菌种确认后，挑取平板上纯菌落制成浓菌悬液用于甘油冷冻管、瓷珠保藏法保存菌种，挑取平板上纯菌落用于液体石蜡法、斜面定期移植法保存菌种，以上作为标准储备菌种（G2），也称传代用菌种，同时用浓菌悬液转接斜面菌种数支，作为工作用菌种，此为第3代（W3）。5.7.3将第2代（G2）菌种管冷冻保存，将工作用菌（W3）于适当温度下培养适当时间后用于日常检验。5.7.4取一支冷冻保存的第2代（G2）菌种转种于平板和斜面培养基上，平板上的菌种制成冷冻保存管第3代（G3）；斜面培养基的菌种经适当温度下培养适当时间后用作工作用菌种，此同为第3代（W3）。5.7.5将第3代菌种（G3）冷冻或低温保存，将生长、转种后的第2代（G2）菌种经高温灭活处理后丢弃。5.7.6按上述规程操作，直至G4转为W5为止，需重新开启冷冻干燥菌种，重复上述规程操作，保存和使用菌种。5.7.7工作用菌种的传代当工作用菌种代数小于5时，可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种。取在冰箱2～8℃保存的工作用菌种用普通琼脂斜面传代，并将新传代的培养物替代原有的菌种，作为工作用菌种。也可取用标准储备菌种，进行复苏，直接作为工作用菌种。传代时注意无菌操作，并使菌种不死亡，不污染、不丢失。同时实验人员也要采取有效的预防措施进行自我保护，如工作时必须穿工作服，佩带无菌手套，实验完成以后消毒实验进行的区域、实验仪器和器具。如发生意外，如菌种泄漏或人员受伤微生物学检验人员应立即向科室负责人报告以便及时进行处理。5.7.8传代后，按菌种的编号原则编号，并在每一支菌种管上贴上标签，标签内容包括：名称、编号、代数、传代日期、操作人、有效期。交菌种管理员统一保管。同时及时填写《实验菌种记录表》。5.8菌种的保管5.8.1菌种设专人双锁保管，并对所保存的菌种建立《菌种领用登记台账》。所保管的菌种，不能随意转让其他单位和个人，需要时应有单位证明和批准手续方可供应。5.8.2菌种的期间检查与鉴定5.8.2.1在菌种的保存期间，应每天检查保存菌种冰箱的温度并填写《仪器设备工作温度监控记录》。5.8.2.2菌种在保存期内均应根据菌种的特性（工作用菌种每转种两代一次、传代用菌种每三个月一次）检查其菌落性状、革兰染色、显微镜下菌体形态及生化特性等项目，若发现与原菌种变异较大，应予以重新确认并做好《标准菌种确认记录表》。5.8.3菌种的领用与使用微生物检验人员根据检验需要，需到菌种管理员领取工作用菌种或标准储备菌种用于日常检验或验证试验，同时填写《菌种领用登记台账》。5.9菌种（废弃）的销毁5.9.1下列情况的菌种或培养物或被污染的器具等，必须采用121℃、30分钟湿热灭活处理：新一代菌种制备成功后的上一代菌种；使用完后的菌种和带有菌种的器具和培养物；超过有效期的菌种；凡被污染、变异、可疑等异常情况菌种；其他应废弃的菌种。5.9.2废弃菌种的销毁由菌种管理员提出申请，交科室