麻黄汤致足跖胰腺癌分泌活动的超微结构观察

麻黄汤致足跖胰腺癌分泌活动的超微结构观察

呼吸道感染是一种常见的临床疾病。由于污染和抗生素滥用，自我意识的自然体验从7天延长到1个月以上。感冒为万病之首,感冒在西医上无特殊的治疗手段,而祖国医学对感冒等病邪在表的太阳病的治疗有其独特的诊疗手段,通过综合调整人体功能,改善机体内环境,提高免疫调节机能和机体抵御疾病的能力,阻断病情的进一步发展,对减少并发病、后遗症具有积极的作用,二千年的临床实践证明,以发汗作为治疗手段的代表方——麻黄汤在治疗上感,抗病毒方面明显优于抗生素的治疗。为了祖国医学的进一步发扬光大,运用现代科学研究方法及手段分析复方麻黄汤的有效成分,药理作用及毒副作用,开发中药新药,改变剂型,适应国际市场,已势在必行。本研究通过观察汗腺上皮细胞分泌活动的超微结构变化,从形态学上揭示麻黄汤发汗作用的机理。1材料和方法1.1实验动物及仪器Sprague-Dawley白化大鼠(简称SD大鼠),川实动管制第8号,雄性,体重250～300g,由成都中医药大学实验动物中心提供。1.2学生理公司活动剂2.6g/ml麻黄汤(每ml含生药量),由成都中医药大学中药化学教研室提供,10%毛果芸香碱(又名匹鲁卡品),25%乌拉坦由成都中医药大学生理教研室提供,3%戊二醛(磷酸盐缓冲液配制),PH6.8,海化学试剂采购供应站,1%锇酸(英国产),10%甲苯胺兰(醋酸配制),丙酮(上海化学试剂上厂),十二烯基丁二酸酐,甲基内次甲基邻苯二甲酸酐(日本进口上海分装,批号870921),环氧树脂618(富顺晨光化工厂生产),2,4,6-三(二甲基氨基甲基)苯酚(上海试剂三厂),柠檬酸铅,硝酸铅,醋酸双氧铀(重庆北碚化学试剂厂)。1.3半导体温度剂MS302多媒体化生物记录分析系统,由广东药学院研制提供,7151型半导体温度剂,上海医用仪表厂生产,LKB-7800型制刀机,LKB-Ⅴ型切片机,JEOL-100SX型透射电子显微镜,日本电子公司株式会社生产。1.4麻黄汤给药剂量250～300g雄性SD大鼠77只随机分成5组。生理盐水对照组15只,发汗工具药毛果芸香碱组11只,麻黄汤高、中、低剂量组分别是17只。对照组灌胃生理盐水。麻黄汤:高剂量组为人服剂量的30倍(人服剂量26g/dtid),中剂量组为人服剂量的15倍,低剂量组为人组均服剂量的7.5倍,以上4组以1ml/100g灌胃给药。毛果芸香碱组:皮下注射给药35mg/kg。1.5大鼠双术后第3足皮细胞的紫外电泳观察大鼠灌胃生理盐水、麻黄汤后30分钟,1小时,2小时,皮下注射毛果芸香碱后30分钟,1小时观察大鼠皮肤汗点的情况及皮肤电生理的变化,并迅速取每只大鼠双后肢第3足跖底部的肉垫皮肤及皮下组织,将所取的组织固定于3%戊二醛溶液中2小时,pH6.8,温度4℃,1%锇酸后固定1小时,丙酮梯度脱水,环氧树脂包埋,半薄切片用10%甲苯胺兰染色,普通光学显微镜观察,放大倍数400倍,观察汗腺上皮细胞的空泡数,超薄切片采用柠檬酸铅,醋酸铀双重染色,JEOL-100sx透射电子显微镜观察,加速电压80kv。2结果2.1各组大鼠足跖腺探索大鼠足底汗腺系小汗腺属于管状腺,它由导管(真皮内导管和表皮内导管)和分泌部组成,小汗腺分泌部仅一层分泌细胞,分泌方式为局部分泌。分泌部位于真皮和皮下组织交界处或在真皮下1/3处,在分泌管腔周围有肌上皮细胞,其功能是帮助汗腺细胞汗液的泌出,分泌管腔内分泌细胞有两型:(图1)亮细胞和暗细胞,它们的数目大致相等,但亮细胞比暗细胞略大,基底部宽而近腔面窄,含有丰富的糖原颗粒。生理盐水对照组,汗腺分泌部管腔切面数量较少,毛果芸香碱组大鼠足跖汗腺分泌部管腔切面数量最多,且分泌细胞的核下空泡数也最多,此空泡经PAS、阿尔新兰和苏丹Ⅳ染色,排除糖原、酸性粘多糖、脂肪类物质(图2)。麻黄汤组则随浓度的升高,其分泌部管腔横切面数目及分泌细胞的空化率也随之增加,并随药物作用的时间不同,分泌细胞空泡化的程度也不一样(图3)。结果见表1、2。实验结果表明:麻黄汤中、低剂量组于半小时对汗腺分泌细胞的影响与生理盐水组比较差异无显著性(P>0.05),但高剂量组差异有显著性(P<0.05)。麻黄汤高、中、低剂量组灌胃后1小时和2小时对汗腺分泌细胞的影响与生理盐水组比较差异均有极显著性(P<0.01)。麻黄汤作用高峰时间在灌胃后2小时左右,此时与毛果芸香碱组的高峰作用时间1小时对汗腺分泌的影响比较差异也有显著性(P<0.01)。由此可见麻黄汤能影响大鼠足跖汗腺分泌细胞的形态变化,但作用强度不及毛果芸香碱。2.2可汗上皮细胞的超微结构变化2.2.1各组胞外周血因子的微织构变化大鼠足跖汗腺在电镜下观察可分为电子密度低的亮细胞和电子密度高的暗细胞。亮细胞体积大,基底部较宽,近腔面较窄,细胞核圆形靠近分泌管腔侧,核内异染色质附着于核周,个别细胞可见核仁,胞质内有丰富的糖原颗粒和相当量的滑面内质网,线粒体圆形或椭圆形,数量较少位于核下近基底部,嵴呈板层状。暗细胞体积小,近腔面宽而基底部窄,细胞核圆形,胞质内核蛋白体丰富,粗面内质网校多,线粒体圆形或椭圆形,大小不一,数量多,嵴板层状,可见许多电子致密的分泌颗粒,管腔面有大量的微绒毛,分泌细胞间有很多绒毛状皱褶互相嵌合,个别细胞内可见毛细分泌小管,该处质膜形成许多微绒毛并与腺腔相通。分泌管基底膜下可见核小呈梭形的肌上皮细胞,胞浆内有长而富有收缩性的原纤维,原纤维螺旋式走行,其长轴与分泌管方向形成斜形,肌上皮细胞外周还有一层含有胶原纤维的透明基底膜带。毛果芸香碱组:用药半小时,汗腺分泌细胞的明、暗细胞可辩,暗细胞线粒体多,个别线粒体有空化现象,在核下近基底膜可见电子致密的分泌颗粒,有文献报道这些分泌颗粒属唾液粘蛋,胞浆内质网扩张,充满了密度高均质状的分泌物,核蛋白颗粒略有减少。密度低的亮细胞,细胞器较少,线粒体较小,数量也较少,细胞内糖原颗粒减少,相邻两分泌细胞之间的微绒毛指状相嵌减少,细胞间隙增大,内有密度高的均质状分泌物,与细胞内的一样。1小时后,汗腺分泌细胞核由圆形变成不规则形,核内异染色质致密块状分布在核下周膜,粗面内质网脱颗粒,且扩张加剧,池内充满了密度高均匀状的分泌物,核蛋白颗粒减少,线粒体肿胀,脱颗粒断嵴,甚至空泡化,胞浆内糖原颗粒减少至消失(图4),亮细胞内空泡化程度更重,个别细胞除残存少许的膜性结构外,整个细胞都被大小不一的空泡充满,相邻两细胞间隙进一步加宽,大量分泌物充填其内,细胞间毛细分泌小管增大,腔面及细胞间微绒毛数量减少。汗腺分泌管腔的肌上皮细胞呈收缩状。麻黄汤低剂量组:用药半小时汗腺分泌细胞的超微结构与生理盐水对照组无明显差异,1小时分泌细胞内线粒体出现肿胀,分泌细胞的空泡变大,数目增多,细胞间毛细分泌小管轻度扩张,个别分泌细胞内存在微细分泌小管,小管的微绒毛呈短小棒状,分泌细胞浆内有少许密度高的分泌颗粒,2小时的分泌细胞空泡增大、数目增多更为严重。麻黄汤中剂量组:用药半小时汗腺分泌细胞的超微结构改变较同时间低剂量组明显,但与生理盐水组比较无显著性差异(P>0.05),用药1小时,汗腺分泌细胞内出现较多的电子密度高的分泌颗粒,线粒体断嵴脱颗粒现象更加严重,核蛋白颗粒及糖原颗粒进一步减少,胞浆内空泡增大,两分泌细胞间相嵌连结显著减少,腔面微绒毛数目减少。2小时分泌细胞内的线粒体及粗面内质网脱颗粒程度加剧,糖原颗粒减少程度较用药1小时和同时间低剂量组更甚,滑面内质网池内及细胞间隙未见电子密度高呈均质状的分泌物。麻黄汤高剂量组:半小时的超微结构变化类似中浓度组的1～2小时的情况,高剂量组在用药1小时后分泌细胞之间的间隙显著增宽,两细胞间的连接结构消失,间隙内有少量电子密度高的分泌物,分泌细胞的线粒体数量较多,大小不一,嵴脱颗粒及空化现象不及中浓度组2小时的情况。本组用药2小时,分泌细胞内出现相互融合的巨大空泡(图5),此时线粒体断嵴脱颗粒及空泡化现象甚为严重,糖原颗粒消失,细胞间指状相嵌连结消失,有少许电子密度高的分泌物充填其间。2.2.2电子密度与细胞数量实验结果表明:在麻黄汤的各实验组中,高剂量组发汗作用最强,超微结构改变最明显,尤其是灌胃后2小时,汗腺分泌细胞内线粒体空化严重,细胞内巨大空泡形成,糖原颗粒消失,细胞间隙增宽,可见少许电子密度高的分泌物。而毛果芸香碱组的超微结构改变发生较早,与麻黄汤高剂量组比较其致汗腺分泌细胞的超微结构改变有些不同,它使细胞出现巨大空泡,滑面内质网扩张,池内及细胞间隙都出现密度高不定型的分泌物,但糖原颗粒减少、线粒体断嵴脱颗粒及空泡化程度不及麻黄汤高剂量组在用药2小时的情况。3讨论3.1解表流转的实验结果本研究的实验动物全部选用雄性大鼠,排除了雌激素、孕激素对机体基础代谢的影响,灌服麻黄汤后全部大鼠均不制动,减少神经因素对汗腺的影响—当机体精神处于紧张状态,随之而出现的无意识的肌紧张以及刺激代谢的内分泌激素释放增多等原因,产热量显著增加。采用形态学的方法在细胞水平观察汗腺上皮细胞空泡化的改变情况,比单纯涂以和田—高垣氏试剂进行定时计数汗点数精确度更高。汗点计数法虽简单易行,但受外界因素影响大,如:气温、湿度、风力及人为因素。用汗液定量测定法研究解表方药,仅能说明麻黄汤具有发汗作用,其发汗的机理和汗液的成分难以确定,该法操作复杂,要求称量准确,费时,且实验难于在同一时间段内完成。单纯用普通光学显微镜观察,需用大量的实验动物数以排出个体差异存在的汗腺上皮细胞空泡化的正常现象,且需经PAS(过碘酸雪夫氏染色)、阿尔新兰、苏丹Ⅲ或苏丹Ⅳ染色,排出糖原、粘液和脂肪类在制样过程中被抽取而致的空泡现象。本课题采用透射电子显微镜技术—半薄切片和超薄切片,不受环境因素制约,取材快速准确,实验结果准确可靠,且有统计学意义,该法不仅从细胞学水平,而且从细胞分子学水平上动态地观察汗腺上皮细胞的分泌活动情况,为麻黄汤的发汗解表作用在临床上运用提供强有力的形态学依据。3.2对大鼠足底部麻黄的影响八十年代中期曾有学者提出这样的问题——麻黄汤使正常皮肤温度降低,它的解热作用究属汗腺作用、血管作用还是中枢及外周神经作用的问题?国外学者做了实验将麻黄碱给猫静注(70mg/只猫),则其后肢足跖放散的水分量增加,这种作用在切断坐骨神经时便消失。说明麻黄碱的发汗作用是经过神经途径进行。采用徐守中的方法,观察麻黄汤对体温中枢调定点的影响,结果表明麻黄汤能明显降低耳朵温度、舌下温度(P<0.05)。发汗作用机制可能是作用于下丘脑的体温调节中枢,使体温调定点下降,通过神经途径,使汗腺分泌增加,从而降低体温。用20%麻黄煎剂100ml/只猫,皮下注射及30ml/只猫口服,未见有上述作用,应用2mg/kg以上口服剂量,方可促进大鼠足底部发汗,提示单味麻黄发汗作用弱,麻黄的发汗作用在达最低起效计量后呈现计量依赖性,有实验证明麻黄制成水溶性提取物给大鼠口服,结果显示在75～300mg/kg的范围内呈现剂量依赖性发汗作用,浓度越高,发汗作用越强。麻黄汤君药为麻黄,主要成分是麻黄碱,属于混合作用类型,有拟交感胺作用:①麻黄碱的化学结构与肾上腺素相似,能直接与肾上腺素能α和β受体结合,产生拟肾上腺素样作用;②麻黄碱亦作用于肾上腺素能神经末梢,促使去甲肾上腺素的释放。有研究报道:汗腺、唾液腺、泪腺上存在α受体和M受体,小汗腺的支配神经属交感神经,但其节后纤维为胆碱能纤维,麻黄中含有拟肾上腺素能效应成分,其作用可直接兴奋α受体并可间接促交感神经兴奋引起腺体分泌增加,乙酰胆碱也能促进小汗腺的分泌。麻黄除含麻黄碱外,还含有伪麻黄碱,伪麻黄碱有抑制血管通透性作用,机体的体温调节机构通过交感神经系统控制着皮肤血管的口径,当交感神经兴奋性增大,皮肤小动脉收缩,皮肤血流量因而减少,皮肤温度降低。麻黄油即麻黄挥发油是麻黄的又一主要有效成分,有实验研究,用10%的麻黄油乳剂以每公斤2ml灌胃,对用牛乳引起发热的兔有解热作用,麻黄油可兴奋汗腺,使汗腺分泌活动加强,对流感病毒(亚甲型,AR8)亦有明显的抑制作用,对正常小鼠有降温作用。综上所述,麻黄汤的发汗机理是以中枢神经途径为主,同时也有汗腺和局部血管的协同作用。3.3第1代生物毛果芸香碱(又名匹鲁卡品Pilocarpine)是植物中提取的生物碱,属叔胺类化合物,1874年Coutinhou证实咀嚼毛果芸香属植物叶可使唾液分泌增加,1875年提取了生物碱,该生物碱能激动M胆碱受体(M-AchR毒蕈碱样已酰胆碱受体),通过与细胞膜表面的GTP(三磷酸鸟苷)结合蛋白的相互作用,跨膜转递信号,产生兴奋或抑制,不改变细胞膜Na+、Ca+离子通透性,产生M样作用,对眼和腺体的作用最明显。毛果芸香碱滴眼,能产生缩瞳,降低眼内压和调节痉挛等作用,对泪腺、胃腺、胰腺、小肠腺和呼吸道粘膜分泌均可增加。另外,付交感神经兴奋,引起心率减慢,心肌收缩力减弱,全身血管扩张,血压下降,支